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N-乙酰半胱氨酸通过抑制HIF-1α下调肝癌HepG2细胞survivin和VEGF表达的实验研究*

王涛1　温桂海1　张桂东1　李恩君1　武向鹏1　苑昭奖1　王杰2

(1.邯郸市中心医院普外一科，河北 邯郸 056001;2.重庆市中医院呼吸内科，重庆 400011)

【摘要】　目的　探讨在低氧环境下N-乙酰半胱氨酸(NAC)能否通过抑制HIF-1α合成下调肝癌HepG2细胞survivin和VEGF的表达。方法　将肝癌HepG2细胞分为3组，分别为常氧组(Normoxia组)、低氧组(Hypoxia组)和NAC+低氧组(NAC+Hypoxia组)。在低氧环境下对肝癌HepG2细胞使用NAC进行干预，在不同时间点(0h、24h和72h)采用MTT法对HepG2细胞的活性进行检测；同时在干预24h后，使用qPCR法和western blot法对HepG2细胞survivin、VEGF和HIF-1α的mRNA和蛋白水平进行检测。结果　低氧环境下肝癌HepG2细胞活性呈时间依赖性下降，差异有统计学意义(P<><0.05)。在低氧环境下24h后hepg2细胞survivin、vegf和hif-1α><0.05)；但nac+低氧组细胞survivin、vegf和hif-1α><>

【关键词】　N-乙酰半胱氨酸；缺氧诱导因子-1α；survivin；血管内皮生长因子；HepG2细胞

由于肿瘤细胞增殖、分化和生长的无序性和肿瘤血管生成的异常，导致肿瘤特别是实体肿瘤组织内部出现不同程度的缺氧[1-5]。目前大量基础研究发现低氧(hypoxia)或者缺氧环境可成为诱导和促进肿瘤演进的重要因素[1-6]。并有研究认为缺氧相关的组织微环境在包括肝癌、非小细胞肺癌及直结肠癌等多种肿瘤细胞的增殖(proliferation)、侵袭(invasion)、分化(differentiation)、转移(metastasis)和肿瘤血管生成(angiogenesis)的过程中扮演着重要的角色[1-6]。同时进一步的实验发现缺氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)对缺氧环境中的肿瘤细胞的生物学特性具有重要的调控作用[1-6]。多个研究表明抑制HIF-1α的表达或活化可以有效抑制多种肿瘤的血管生成和肿瘤细胞的增殖[1-6]。目前实验发现N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对结肠癌等多种实体肿瘤细胞的增殖有显著的抑制作用，并认为与抑制HIF-1α的表达密切相关[7]。本研究的目的是探讨在低氧环境下NAC对于肝癌HepG2细胞的抑制作用及其潜在的分子机制。

1　材料和方法

1.1　主要试剂和材料　RNA提取试剂盒和qPCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；鼠抗人survivin抗体、鼠抗人VEGF抗体、鼠抗人HIF-1α抗体和鼠抗人β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司；N-乙酰半胱氨酸购自美国Sigma公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；小牛血清购自澳大利亚Gibco公司；MTT试剂盒购自美国Promega公司；其余试剂均为分析纯。

1.2　方法

1.2.1　细胞培养　肝癌HepG2细胞常规接种在含10%胎牛血清、100g/L 青霉素、100g/L链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、95%空气、5% CO2孵箱内培养。每48 h换液、传代1次，取对数生长期细胞用于实验。HepG2细胞分为常氧组(Normoxia组)、低氧组(Hypoxia组)和低氧+N-乙酰半胱氨酸组(Hypoxia+NAC组)。其中常氧组和低氧组细胞加入PBS，NAC+低氧组加入溶于0.5% DMSO终浓度为40mM的N-乙酰半胱氨酸溶液，而后将低氧组和NAC+低氧组细胞移置于低氧环境(1% O2、5% CO2和94% N2)进行培养。

1.2.2　细胞活性检测　取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔接种100μl约含5×103个细胞。使用MTT比色试验对NAC干预后不同时间点(0h、24h和72h)的细胞生长状态进行测定，实验重复4次。细胞活性(%) = (OD样本/OD 常氧组0h) × 100 (%) [8]。

1.2.3　qPCR法检测细胞中survivin、VEGF和HIF-1α mRNA表达检测　干预24h后，按照qPCR试剂盒说明书提取细胞总RNA。引物：survivin正义5′-CATGGG TGCCC CGACGTTG-3′，反义5′-GCTC CGGCCAGAGGC CTCAA-3′；VEGF正义5′-TACCTCC ACCATGCCAA GTG-3′，反义5′-ATGATT CTGCCCTC CTCCTTC-3′；HIF-1α正义 5′-CGTTC CTTCGATCA GTTGTC-3′，反义5′-TCAGT GGTGGCA GTGGTAGT-3′；β-actin正义：5′-CATGTAC GTTGCTAT CCAGGC-3′，反义：5′-CTCCTTAATG TCACGCACGAT-3′。按照试剂盒说明书介绍进行反转录和扩增实验。使用2-ΔΔCt法对survivin、VEGF和HIF-1α mRNA表达水平进行测定，ΔΔCt = (Ct,目标-Ct,β-actin)干预组-(Ct,目标-Ct,β-actin)对照组[9]。

1.2.4　Western blot法检测细胞中survivin、VEGF和HIF-1α蛋白表达　干预24h后，按照试剂盒操作要求，首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1 h，分别加入鼠抗人单克隆抗体survivin(1∶1000)、VEGF (1∶1000)、HIF-1α (1∶1000)和β-actin (1∶1200)，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

1.3　统计学分析　采用SPSS17.0进行单因素方差分析，两样本均数多重比较采用LSD法，计量资料以均数±标准差表示。P<>

2　结果

2.1　细胞活性测定比较　在低氧环境中，肝癌HepG2细胞活性随时间延长而逐渐下降，差异均有显著统计学意义(P<><>

表1　MTT比色法测定HepG2细胞活性

Table 1　Cell viability of HepG2 cells at different time points (0 h,24h,and 72h)

分组 0h24h72hNAC+低氧组101.2±4.262.7±14.5①38.4±16.9①低氧组98.7±3.781.6±8.274.3±11.2

注：与对应时间点低氧组相比较①P<>

2.2　survivin mRNA和蛋白的表达　在干预24h后，低氧环境下HepG2细胞survivin mRNA和蛋白表达较常氧环境下显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；同时与低氧组比较，nac+低氧组细胞survivin><>

2.3　VEGF mRNA和蛋白的表达　在干预24h后，低氧环境下HepG2细胞VEGF mRNA和蛋白表达较常氧环境下显著增加，差异有统计学意义(P<><>

表2　肝癌HepG2细胞survivin mRNA的表达

Table 2　The mRNA expression of survivin in liver cancer HepG2 cells

分组 survivinmRNA表达survivin蛋白表达常氧组10.09±0.02NAC+低氧组7.38±2.27①②0.41±0.11①②低氧组19.46±6.58① 0.97±0.05①

注：与常氧组相比较，①P<><>

图1　肝癌HepG2细胞survivin表达的western blot结果

Figure 1　Western blot results of survivin in liver cancer HepG2 cells

表3　肝癌HepG2细胞VEGF和HIF-1α mRNA的表达

Table 3　The mRNA expression of VEGF and HIF-1α in liver cancer HepG2 cells

分组VEGFmRNA表达VEGF蛋白表达HIF-1αmRNA表达HIF-1α蛋白表达常氧组10.13±0.0410.22±0.06NAC+低氧组4.21±1.58①②0.39±0.127.81±3.22①②0.41±0.06低氧组14.23±5.47①0.96±0.0421.33±9.12①0.95±0.05

注：与常氧组相比较①P<><>

2.4　HIF-1α mRNA和蛋白的表达　在干预24h后，低氧环境下HepG2细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达较常氧环境下明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与低氧组比较，nac+低氧组细胞hif-1α><>

图2　肝癌HepG2细胞VEGF和HIF-1α表达的western blot结果

Figure 2　Western blot results of VEGF and HIF-1α in liver cancer HepG2 cells

3　讨论

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝胆系统恶性肿瘤，流行病学调查显示在人类最常见的恶性肿瘤中肝细胞癌位居第五位，统计显示每年的新发病例数男性约为52.3万(占男性恶性肿瘤总发病人数的7.9%)，女性约为22.6万(占女性恶性肿瘤总发病人数的6.5%) [10-15]。由于我国是慢性乙型肝炎病毒感染人数比例较高，也致使我国肝细胞癌的发病率明显高于全球平均水平，我国因肝细胞癌死亡的人数占全球肝细胞癌死亡人数的50%以上[10-15]。故探索和发现新的治疗肝细胞癌的药物和方法具有重要的价值和意义。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作为左旋精氨酸的衍生物具有多种生物学和药理学活性[16]。NAC是一种含有巯基(-SH)的化合物，其可以通过裂解粘液性分泌物中粘蛋白的二硫键(-S-S)诱导粘蛋白分解，有效降低如痰液等分泌物的粘性，促进分泌物的排除。目前多用于急慢性鼻窦炎和慢性支气管炎等呼吸系统疾病的治疗[16]。进一步的研究还显示NAC对于过度的氧化应激亦有显著的抑制作用[16-17]。Xue L等的研究发现NAC对于微囊藻毒素LR (microcystin-LR)诱导的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster ovary cells,CHO cells)氧化应激反应有显著的抑制作用[17]。还有研究证实NAC对包括胃肠道肿瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和口腔鳞状细胞癌等多种肿瘤细胞的增殖、分化、转移以及肿瘤血管生长具有显著的抑制作用[18-19]。如Lee MF等的研究发现NAC可以有效抑制人舌鳞状细胞癌HSC-3细胞和SCC-4细胞的增殖和分化，同时有效下调肿瘤细胞EGFR/Akt的活化水平[18]。Lee YJ等的研究证实NAC对于前列腺癌PC-3细胞的增殖具有剂量依赖性的抑制作用[19]。本研究中我们发现在低氧环境中肝癌HepG2细胞活性随时间延长而逐渐下降(P<><>

缺氧(hypoxia)环境可直接促进肿瘤细胞向高侵袭性和耐药性等方向演进。进一步的研究表明该过程与缺氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)的表达密切相关[8,20]。HIF-1作为一种异二聚体主要受到组织O2的调控，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两个亚基构成。在非激活状态下(常氧环境中)细胞内的HIF-1α通过E3泛素蛋白连接酶(E3 ubiquitin-protein ligases)持续的诱导并通过泛素化降解；当在低氧环境中时E3泛素蛋白连接酶的活性被抑制，导致HIF-1α与HIF-1β的结合形成HIF-1α/HIF-1β异二聚体发挥生物学效应[8,20]。研究显示HIF-1对包括肝细胞癌和非小细胞肺癌在内的多种肿瘤的血管生成、分化、增殖、侵袭和转移均有重要的调节作用，下调HIF-1的表达和活化对于肿瘤细胞有抑制作用[8,20-21]。如Wei D等的研究发现地高辛可以通过下调HIF-1α的合成有效抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和N-Myc downregulated gene 1 (NDRG1)的表达[8]。吴晓慧等通过细胞实验和移植瘤小鼠实验证实YC-1对于肝细胞癌SMMC-7721细胞有直接的抑制作用并可下调肿瘤细胞VEGF的表达，同时发现该作用机制与抑制HIF-1α的合成密切相关[21]。Hu Y等在对多发性骨髓瘤细胞的研究中证实HIF-1α对于survivin的表达具有关键性调控作用，使用siRNA等方法抑制HIF-1α可有效下调骨髓瘤细胞survivin的合成[22]。在本实验中我们对survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表达使用qPCR和western blot进行分析后发现低氧环境可以显著增加肝癌HepG2细胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表达水平。同时还发现在干预24h后，NAC+低氧组细胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表达水平较低氧组细胞显著下降(P<>

4　结论

低氧环境中N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可以通过下调HIF-1α的合成抑制肝癌HepG2细胞survivin和VEGF的表达水平，并可有效抑制肿瘤细胞的增殖。本基础研究为进一步NAC应用于肿瘤的临床治疗奠定了一定的理论基础。

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基金项目：重庆市卫生和计生委中医药科技项目(ZY201402030)

【中图分类号】　R 735.7　　

【文献标志码】　A　　　

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.004

(收稿日期：2015-08-19；编辑：陈舟贵)

N-acetylcysteine inhibits survivin and VEGF expression through down-regulation of HIF-1α in liver cancer HepG2 cells

WANG Tao1,WEN Guihai1,ZHANG Guidong1,et al

(1.Department of The First General Surgery,Handan Central Hospital,Handan 056001,Hebei,China;2.Department of Respiratory Medicine,Traditional Chinese Medical Hospital of Chongqing,Chongqing 400011,China)

【Abstract】　Objective　To explore the role of N-acetylcysteine (NAC) on survivin and VEGF expression in liver cancer HepG2 cells in hypoxia,and its underlying mechanism.Methods　Liver cancer HepG2 cells were divided into three group,Normoxia group,NAC+Hypoxia group and Hypoxia group.At different time points (0h,24h and 72h),cell viabilities were measured by MTT assay.After 24 hours interventions,survivin,VEGF and HIF-1α mRNA were evaluated by qPCR.Meanwhile,the protein expression of survivin,VEGF and HIF-1α protein were detected by Western blot.Results　The proliferation of liver cancer HepG2 cells under hypoxic conditions was time-dependently reduced by NAC interventions.And we found that hypoxia up-regulated the mRNA and protein expression of survivin,VEGF and HIF-1α in HepG2 cells.Then,our data also figured out that hypoxia-induced up-regulation of survivin,VEGF and HIF-1α was significantly blocked by NAC.Conclusion　NAC reduces survivin and VEGF expression probably through the inhibition of HIF-1α in liver cancer HepG2 cells in hypoxia.

【Key words】　N-acetylcysteine; Hypoxia-inducible factor-1α; Survivin; Vascular endothelial growth factor; HepG2 cells