肝细胞性肝癌中p28GANK基因的表达与凋亡基因bax、bcl-2表达的关系▲莫瑞祥1 杨 威1 李西融2 廖文胜1 张慧明1 陈泽峰1 黄 芳1 (广西壮族自治区南溪山医院 1外一科；2 病理科，桂林市 541002) 【摘要】目的 探讨p28GANK基因在肝细胞性肝癌组织中的表达及其与细胞凋亡的关系。方法 收集肝细胞性肝癌组织68例、正常肝组织30例，采用免疫组化法检测标本中p28GANK基因、凋亡基因Bcl-2和Bax的表达情况。结果 p28GANK在肝细胞性肝癌和正常肝组织中的阳性表达率分别为73.5%和6.7%，肝细胞性肝癌中p28GANK基因的表达高于正常肝组织(P<>P<>P<>P<>P>0.05)。结论 p28GANK蛋白表达与肝细胞性肝癌的发生发展可能相关，p28GANK和凋亡抑制基因Bcl2的共同表达可能在肝细胞性肝癌中起协同作用。 【关键词】肝肿瘤；p28GANK；Bcl-2；Bax；免疫组织化学 研究表明,p28GANK基因主要参与了Rb、MDM2-p53等重要信号途径的调控,调控细胞周期进程、促进细胞增殖并抑制细胞凋亡[1～3]。本研究通过p28GANK基因、凋亡因子Bcl-2、Bax的联合检测，观察p28GANK基因、Bcl-2 和Bax在肝细胞性肝癌的表达情况，探究肝细胞性肝癌发生发展的可能机制及在此过程中p28GANK基因的表达与细胞凋亡的关系。 1 材料与方法1.1 临床资料 标本选取2010年1月至2015年12月我院病理科存档的蜡块标本，肝细胞性肝癌68例，正常肝组织30例，病例均未接受放疗和化疗。肝细胞性肝癌病例中，男42例，女26例，年龄21～72岁，中位年龄40岁。标本均经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚4 μm。 1.2 主要试剂 兔抗人p28GANK单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，Bcl-2鼠抗人单克隆抗体(即用型)、Bax鼠抗人单克隆抗体(即用型)、S-P法即用型抗兔免疫组织化学超敏UltraSensitiveTM SP试剂盒、正常非免疫羊血清和DAB显色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。 1.3 免疫组织化学S-P法染色及评估 组织芯片切片脱蜡、水化后，置入3%H2O2中室温30 min，以阻断内源性过氧化物酶，正常非免疫羊血清室温封闭30 min，分别滴加p28GANK抗体(浓度1：50)、Bcl-2抗体(即用型)和Bax(即用型)抗体，置密封湿盒中4℃过夜，滴加即用型生物素标记二抗和标记过氧化物酶的链霉菌抗生物素蛋白，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。用已知阳性的结肠腺癌切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。 1.4 评估方法 参照文献[4]评估结果，由两位未知患者临床病理资料的资深病理医师独立观察， p28GANK免疫组化染色阳性表达位于细胞质和胞核，bcl-2和bax的阳性表达主要位于细胞质。每例标本至少随机观察3个视野(×200)，根据阳性细胞比例和染色强度判定染色结果。无阳性细胞记0分，阳性细胞<30%记 1分，30%～60%记2分，="">60%记3分；无染色记0分，弱阳性记1分，阳性记2分，强阳性记3分。两项评分分值相加0～2分为表达阴性，3～6分为阳性。
1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件包处理，计数资料比较采用卡方检验， 组间相关性采用spearman相关分析，以P<> 2 结 果2.1 p28GANK基因和凋亡基因bax、bcl-2的表达 免疫组化检测结果见图1。p28GANK表达阳性染色主要位于细胞质和细胞核中，为粗细不一的棕黄色颗粒。68例肝细胞性肝癌组织中有50例p28GANK表达阳性，阳性率为73.5%。30例正常肝组织中有2例p28GANK呈弱阳性表达，阳性率为6.67%。肝细胞性肝癌组织与正常肝组织相比，p28GANK的表达差异有统计学意义(P<> Bax、Bcl-2阳性产物为棕黄色颗粒，主要定位于细胞质中。68例肝细胞性肝癌组织中有15例Bax呈阳性表达，表达率为22.1%，而30例正常肝组织中有20例Bax呈阳性表达，阳性率为66.7%。肝细胞性肝癌组织Bax的表达明显低于正常肝组织(P<0.05)。bcl-2在68例肝癌组织中有45例呈阳性表达，阳性率为>P<> 表1 p28GANK、bax、bcl-2在肝细胞性肝癌和正常肝组织中的表达 [n(%)]  组织类型合计p28GANK阳性阴性Bax阳性阴性bcl-2阳性阴性肝细胞性肝癌6850(73.5)18(26.5)15(22.1)53(77.9)45(66.2)23(33.8)正常肝组织302(6.67)28(93.33)20(66.7)10(33.3)9(30.0)21(70.0)χ2值37.36518.04111.012P值<><><> 2.2 免疫组化检测 45例Bcl-2阳性表达者中p28GANK阳性表达占33例，阳性率为73.33%；而23例Bcl-2阴性表达者中p28GANK阳性表达占9例，阳性率为39.13%15例Bax阳性表达者中p28GANK阳性占10例，阳性率为66.67%；而53例Bax阴性表达者中p28GANK阳性表达40例， 阳性率为75.47%。    p28GANK Bcl-2 Bax 图1 p28GANK基因、Bax基因、Bcl-2基因在肝细胞性肝癌组织中的表达(亲和组化染色法，×400) 3 讨 论3.1 p28GANK表达与肝细胞性肝癌发生发展的关系 细胞凋亡与肿瘤关系密切，细胞凋亡及其调控基因异常是肿瘤发生的重要机制之一，多种基因参与细胞凋亡的调控，与细胞增殖平衡的失调在肿瘤的病程中起重要作用[5]。p28GANK促进肿瘤恶性进展机制主要与MDM2-p53、Rb等通路相关。MDM2-p53通路在肿瘤发生发展中起重要作用，MDM2在多数肿瘤细胞中有促进细胞恶性转变潜能。研究表明，p28GANK能够与MDM2 N-端RING结构域结合而激活后者引起构象变化，从而发挥与p53结合功能，促进p53泛素化而降解，促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，导致肿瘤细胞恶性转化[6-8]。Rb蛋白能够调节肿瘤细胞增殖、凋亡等多种恶性生物学行为，p28GANK过表达可以促进Rb磷酸化，使其出核后在胞浆降解[9，10]。陈平平等[11]报道，p28GANK 在肝门胆管癌表达显著高于正常胆管上皮组织，其高表达与肿瘤恶性程度呈正相关，对于肝门胆管癌患者术后预后判断具有一定有指导意义，也为胆管癌诊断及生物靶向治疗提供新的思路。文献报道p28GANK 在食管癌、结肠癌、胰腺导管癌[12～14]等消化道恶性肿瘤中表达显著增强。本文应用免疫组化检测p28GANK表达，肝细胞性肝癌组织中阳性率为73.5%，正常肝组织阳性率为6.7%，肝细胞性肝癌组织表达率明显高于正常肝组织，提示p28GANK基因表达与肝细胞性肝癌的发生可能相关，p28GANK有作为肝癌的辅助肿瘤标记物的潜质。 3.2 Bcl-2和Bax与肝细胞性肝癌的发生相关 Bcl-2和Bax一对凋亡因子，Bcl-2抑制凋亡而Bax促进调亡，它们可以通过调控细胞凋亡而达到调节肿瘤细胞的生长状态，凋亡抑制因子Bcl-2蛋白的过度表达已被证实存在于多种肿瘤组织中[15]。杨连君等[16]报道，Bcl-2在正常肝组织的阳性率只有4.2%，而在肝癌组织为25.8%，差异显著。Bax在正常肝组织的阳性率为70.8%，在肝癌组织为43.9%，差异显著，肝癌组织的Bcl-2和Bax阳性率与其病理分级之间均未见明显的相关性。本文应用免疫组化检测68例肝细胞性肝癌组织中Bcl-2和Bax阳性表达率，肝细胞性肝癌组织Bcl-2的表达明显高于正常肝组织而肝细胞性肝癌组织Bax的表达明显低于正常肝组织，说明Bcl-2和Bax与肝细胞性肝癌的发生有密切关系。 3.3 p28GANK和凋亡抑制基因Bcl-2的共同表达可能在肝细胞性肝癌中起协同作用 本研究中结果显示，45例Bcl-2阳性表达者中p28GANK阳性表达占33例，阳性率为73.33%；而23例Bcl-2阴性表达者中p28GANK阳性表达占9例，阳性率为39.13%，推测p28GANK与Bcl-2可能通过作用于细胞凋亡的不同阶段协同发挥抗凋亡效应，从而在促进肿瘤发生、发展中起协同作用；而p28GANK与Bax可能通过不同途径对凋亡起作用。因细胞凋亡过程存在一个复杂的调控网络，故肝癌中细胞凋亡各个信号途径之间的相互联系与相互作用仍需进一步研究。 参 考 文 献： [1] Higashitsuji H, Liu Y, Mayer RJ, et al.The oncoprotein gankyrin negatively regulates both p53 and RB by enhancing proteasomal degradation[J].Cell Cycle,2005,4(10):1335-1337. [2] Sdek P, Ying H, Chang DL, et al.MDM2 promotes proteasome-dependent ubiquitin-independent degradation of retinoblastoma protein[J].Mol Cell,2005,20(5):699-708. [3] Rezvani K, Mee M, Dawson S, et al.Proteasomal interactors control activities as diverse as the cell cycle and glutaminergic neurotransmission[J].Biochem Soc Trans,2003,31(2):470-473. [4] 蔡炜龙,许洪宝,汪伟民.p28GANK在结肠癌中的表达及其意义[J].胃肠病学,2013,18(2):105-108. [5] 李 娜,高俊岩,刘 敏.细胞凋亡和肿瘤的关系研究进展[J].当代医学,2009,15(16):13-14. [6] Momand J, Zambetti GP, Olson DC, et al.The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation[J].Cell,1992,69(7):1237-1245. [7] Zheng N, Wang P, Jeffrey PD, et al.Structure of a c-Cbl-UbcH7 complex: RING domain function in ubiquitin-protein ligases[J].Cell,2000,102(4):533-539. [8] Higashitsuji H, Higashitsuji H, Itoh K, et al.The oncoprotein gankyrin binds to MDM2/HDM2, enhancing ubiquitylation and degradation of p53[J].Cancer Cell,2005,8(1):75-87. [9] Stevaux O, Dyson NJ.A revised picture of the E2F transcriptional network and RB function[J].Curr Opin Cell Biol,2002,14(6):684-691. [10]Tan L, Fu XY, Liu SQ, et al.Expression of p28GANK and its correlation with RB in human hepatocellular carcinoma[J].Liver Int,2005,25(3):667-676. [11]陈平平,刘初平,李灼日.p28GANK 在肝门胆管癌表达的意义及其与预后的关系[J]. 中国普通外科杂志,2014,23(1):64-68. [12]赵国宏,汤善宏,康建琴,等. p28GANK 的表达与食管鳞癌转移的相关性[J]. 细胞与分子免疫学杂志,2013,29(1)：42-45. [13]蔡炜龙,许洪宝,汪伟民. p28GANK在结肠癌中的表达及其意义[J]. 胃肠病学,2013,18(2)：105-108. [14]陈平平,李灼日. p28GANK在胰腺导管癌中表达的临床意义[J]. 中国普通外科杂志,2014,23(3)：333-337. [15]Konturek PC, Konturek SJ, Sulekova Z, et al.Expression of hepatocyte growth factor, transforming growth factor alpha, apoptosis related proteins Bax and Bcl-2, and gastrin in human gastric cancer[J].Aliment Pharmacol Ther,2001,15(7):989-999. [16]杨连君,王文亮.肝细胞癌组织Bcl-2和Bax蛋白的表达[J].学报,2002,23(4)：337-340. Expression of p28GANK gene in hepatocellular carcinoma and its relationship with Bcl-2 and Bax expression MO Ruixiang1, YANG Wei1, LI Xirong2, LIAO Wensheng1, ZHANG Huiming1, CHEN Zefeng1, HUANG Fang1 (1Department of Surgery, 2 Department of Pathology, Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Guilin, 541002, China) 【Abstract】Objective To investigate the expression of p28GANK gene in hepatocellular carcinoma(HCC) and its relationship with apoptosis. Methods 68 cases of hepatocellular carcinoma and 30 cases of normal liver tissues were collected. The expression of p28GANK gene and apoptosis gene Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry in HCC and normal liver tissues. Results The positive expression of p28GANK in HCC and normal liver tissues were 73.5%，6.67%, respectively. p28GANK in HCC was significantly higher than that in normal liver tissues(P<0.01). the="" expression="" of="" bax="" in="" hcc="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" normal="" liver="" tissues="">P<0.05), but="" the="" expression="" of="" bcl-2="" in="" hcc="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" normal="" liver="" tissues="">P<0.05). the="" expression="" of="" p28gank="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" bcl-2="">P<0.05), but="" not="" correlated="" with="">P>0.05). Conclusion The expression of p28GANK protein may be related to the tumorigenesis and progress of hepatocellular carcinoma, and the co-expression of p28GANK and apoptosis inhibitory gene Bcl-2 may play a synergistic role in HCC. 【Key words】Liver neoplasms; p28GANK; Bcl-2；Bax；Immunohistochemistry ▲基金项目：广西医疗卫生重点科研课题(编号：重2012014) 作者简介：莫瑞祥(1965～)，男，本科，主任医师，研究方向：肝胆肿瘤的基础与临床研究。 【中图分类号】R 735.7 【文献标识码】A 【文章编号】1673-6575(2016)06-0823-03 DOI：10.11864/j.issn.1673.2016.06.03 (收稿日期：2016-08-04 修回日期：2016-09-30) |
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