淋巴瘤的规范化病理诊断-刘卫平

演讲者：
四川大学华西临床医学院，刘卫平
文字整理者：
陕西省咸阳市中心医院病理科，马晓燕
视频链接：
http://news./train/play/W0QQidZ11
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各位观众、各位听众，大家好！我们今天学习的内容是淋巴瘤的规范化病理诊断，这部分内容参加编写的有复旦大学上海肿瘤医院病理科的李小秋教授、北京友谊医院病理科的周小鸽教授、西病理科的王哲教授和我。参加这部分审稿的还有很多国内的一些知名专家。

我们今天讲课的内容主要是两个方面。首先我们要学习一下关于淋巴增生性疾病的一些主要的诊断术语，主要有两个；然后重点内容是淋巴瘤的规范化病理诊断，涉及3个方面的内容。

（一）我们先来看一下诊断术语。诊断术语有两个，一个是淋巴瘤，一个是淋巴组织肿瘤。

我们首先看一下淋巴瘤。淋巴瘤无论是不是加了“恶性”，即无论是不是“恶性淋巴瘤”，我们知道淋巴瘤都是恶性的，没有良性的淋巴瘤。淋巴瘤的定义是淋巴细胞及其前体细胞的克隆性增生而形成的一类恶性肿瘤。这个肿瘤可以发生在淋巴结，也可以发生在淋巴结外的其他它器官和组织，而发生肿瘤性增生的细胞成分就是淋巴细胞，包括B细胞、T细胞还有自然杀伤细胞。由于这些淋巴细胞也是机体的免疫系统的一个重要组成成分，所以说淋巴瘤也是机体免疫系统、免疫细胞发生的一类恶性肿瘤。

我们再来看一看淋巴组织肿瘤。淋巴组织肿瘤和淋巴瘤比较起来，相对来讲概念上更为宽泛一些，它除了包括淋巴瘤以外，还包括淋巴组织里面的其它一些成分发生的肿瘤，所以还包括一些良性的病变，即有一些良性肿瘤成分也包括在内。

下面我们看一下发生在不同器官的一些淋巴瘤的大体表现。这个图我们可以看到是一个鼻的、也就是发生在中线面部的一个NK/T细胞淋巴瘤的大体表现；这边这幅图我们看到的就是一个小孩的霍奇金淋巴瘤的大体表现。这是发生在身体的不同器官的一些淋巴瘤：左上是乳腺的一个淋巴瘤，右上是一个脾脏的淋巴瘤，左下仍然是脾脏的淋巴瘤，（右下）这个是一个大B细胞淋巴瘤发生全身扩散的时候，出现皮肤多发性的结节性病变。

接下来我们看一些发生腔道器官的，主要是胃肠道的淋巴瘤。比如发生在胃的大B细胞淋巴瘤；发生在肠道的一些淋巴瘤，表现为一个息肉样病变；这也是发生在肠道的一个淋巴瘤，表现为局部肠壁的弥漫性增厚，同时有一个溃疡性的病变；这个是发生在纵膈、胸腺原发的一个大B细胞淋巴瘤，表现为局部的一个占位和分叶状的结构，切面比较细腻。

这是来自我们四川大学华西医院病理科的一个单中心大样本的淋巴瘤病例的组织学构成分析。从这个构成图我们可以看到：在所有的非霍奇金淋巴瘤里面，我们这组病例最常见的是弥漫大B细胞淋巴瘤，其次是结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤。这样的一个淋巴瘤的构成和西方的一些报道有明显的不同。接下来我们再看第二个数据：基因重排。免疫球蛋白和T细胞受体基因重排技术是用于检测B细胞和T细胞的克隆性，协助我们对淋巴增生性疾病的病变性质作出判断。在正常情况下，淋巴细胞在其分化的过程中发生抗原受体的基因重排，它的结果导致每一个淋巴细胞都有各自独特的一个基因型，在这种情况下DNA的电泳上就表现为一个涂层，也就是“smear”。这样的结果就提示是一个多克隆性增生。而淋巴瘤是淋巴细胞阻断在某一个分化阶段，在这个阶段里这些细胞发生增殖，而增殖的所有这些子细胞和它的母细胞具有相同的基因编码，扩增的DNA片段的长度也是相同的。因此，在DNA电泳图上就形成一个单一条带。这个就提示克隆性增生。基因重排的检测从DNA的提取和扩增，然后最早是琼脂糖电泳、之后是聚丙烯酰胺凝胶电泳、到现在通过毛细管电泳，从观察条带到观察丰度，使基因重排这一检测结果的准确性更加地好。

（二）接下来我们就来看看淋巴瘤的规范化病理诊断。我们从以下3个方面来进行讲解。

首先是关于样本取材和制备。淋巴增生性疾病的样本主要有6类：1.淋巴结活检样本；2.结外器官或组织的切除或切取样本；3.淋巴结或结外器官、或组织的钳夹或空心针穿刺样本；然后是两类细胞学样本：4.细胞学穿刺样本；5.体腔积液的细胞学样本；6.新鲜组织冷冻样本。我们分别来看一下。

首先来看淋巴结的活检样本。它是大多数淋巴增生性疾病的病理诊断的主要检材来源，因为淋巴结在人体内分布很广，数量也最多，而且在发生浅表淋巴结肿大的时候很容易察觉，也往往是病人就诊的一个很重要的原因。在淋巴结活检样本的检查过程中，我们要特别注意选择具有代表性的一个样本。如果是多发性的淋巴结肿大，具有代表性的样本是很重要的，一般来讲要尽可能取比较大的；此外，要尽量保证将淋巴结完整地切除；如果不是单一部位的淋巴结肿大，不轻易去选择腹股沟淋巴结做活检，因为经常会有一些炎症性的因素对病变进行干扰，从而影响我们的诊断。淋巴结样本切取以后，我们要对它进行适当的切分，来满足后继的淋巴增生性疾病的辅助诊断的检测需求以及研究的需要。这个病人就是一个淋巴结肿大的完整淋巴结切除样本，可以很清楚地看到淋巴组织的构象，这是很理想的一个样本。对样本的切分处理有一个推荐方案。对于绝大多数的淋巴增生性疾病，通过对样本的恰当切分，我们有足够的样本用于常规的形态学和免疫组织化学染色，90%的淋巴增生性疾病通过这样一个环节，就可以完成它的诊断和组织学分型。有少数的病例需要借助于其他的一些辅助检查手段，包括基因重排检测、原位杂交检测或者是荧光原位杂交检测以及特殊染色来帮助我们完成进一步的诊断，而留下来的一部分标本，我们根据各个实验室的具体情况可以做实体瘤的流式细新胞术检查，以及实体瘤细胞遗传学检查，还有一部分标本可以留在后继的一些方法或者分子生物学方面的一些研究等。

第二个样本类型是器官和组织的切除或者切取样本。这样的样本实际上是发生在身体的不同器官组织的一些病变，它和发生在这些的一些器官和组织的其它的、非淋巴造血组织的疾病是无法区分的。所以对于这样一些器官组织的切除或切取样本，遵照我们病理技术操作规范总的原则和各个医院病理科的一些标本取材的游戏规则来进行。

第三个方面的样本是空心针穿刺或钳夹样本。原则上不推荐使用空心针穿刺来作为淋巴增生性疾病的病理诊断和分型的首选方法。但是这种穿刺活检如果提示是一个淋巴组织肿瘤的时候，我们应该首先建议病人尽量做病变样本的切除或者是切取活检。有些情况下，比如有些病人身体很虚弱，或者一些老年人不能够胜任或者接受手术取材；还有一些比较深部的病变，比如纵膈、腹膜后，或者是腹腔的一些病变，不太容易通过一般的手术来进行活检，不得不选择穿刺。在这种情况下，我们需要结合形态学、结合相关的免疫组化染色以及其他一些辅助检测手段，也还是可以完成淋巴瘤的诊断和组织学分型，这里给大家举个例子。我们的这个病例是一个50岁的女性病人，腹膜后占位，因为位置很深，所以是在影像学引导下的一个穿刺活检，我们看到是一些不整形的碎组织。这样一个组织我们拿到以后可以看到在纤维组织里面有密集增生的异型淋巴细胞，体积中等大小或者中等偏大，在纤维组织内浸润，部分区域有明显的挤压。在这样一个病例，我们根据形态学提供的线索选择一组免疫组织化学染色标记来进行检测，可以看到这些异型增生的细胞表达B细胞分化抗原、表达CD20，提示是一个B细胞的肿瘤。同时我们也可以通过其他一些免疫组织化学染色了解到这个B细胞肿瘤的免疫学亚型以及细胞增殖的情况和预后相关的一些标记的表达情况。结合形态学和免疫组织化学染色的结果，我们可以对这个肿瘤进行诊断并且分型。我们可以看到这是一个弥漫性大B细胞淋巴瘤，高增殖活性，并且这个肿瘤细胞还是bcl-2和c-myc蛋白双表达的。所以我们要建议做荧光原位杂交检测。

我们再看看细胞学样本。主要有两类，一个是体液的细胞学样本，另一个是穿刺细胞学样本。这类样本一个最重要的原则就还是不适合于做淋巴组织肿瘤的病理诊断和分型。但是有些病人可能没有明显淋巴结肿大，或者没有组织和器官的占位，这种情况下，这样的样本也可以完成淋巴组织增生性疾病的诊断。比如说一些富于细胞的体液样本，我们可以通过细胞的富集做成细胞块。做成细胞块以后就和常规的石蜡组织切片一样，可以进行后面的免疫组化、分子检测等各方面的很多工作。这个病例我们可以看到一个体液的细胞学样本，里面有大量的淋巴细胞成分；这是腹水里面我们看到的一些异型淋巴细胞；这是富于细胞的一个腹水的样本，我们先把细胞富集，然后做成细胞块，可以对细胞形态进行很好的观察，同时可以做后继的一些工作；这是给大家看的一个病例，79岁的一个男性病人，是一个胸水，胸水里面有大量的淋巴样细胞，这些细胞基本上都是一些中等大小的，而且形态比较一致；这就是这个病例的胸水细胞进行富集以后做成的细胞块、然后做成的切片，我们看到这些肿瘤细胞的形态就更为清楚，而且细胞的一致性也非常好，考虑可能是一个淋巴增生性疾病，那么选择一组抗体来进行工作。做下来我们可以看到细胞优势表达CD20，提示是一个侵袭性的B细胞肿瘤，而且这个肿瘤仍然是一个双表达，我们看到有bcl-2和c-myc的高表达。其中bcl-2的阈值是50%，c-myc是40%。从汉斯分型相关的MUM-1、bcl-6和CD10这3个标记来看，这个细胞表达了bcl-6和CD10，所以提示是一个生发中心细胞来源的肿瘤。我们还可以在这个细胞块上做荧光原位杂交检测。这个病例我们可以看到通过荧光原位杂交检测，检测到了这个病例有myc基因和bcl-2基因的断裂；同时也可以用这样的样本做基因重排检测，最后完成我们的诊断。这是在细胞学样本上通过细胞块进行后期的辅助工作完成了淋巴瘤的诊断和分型。按照修订的WHO分类，这是一个高级别的B细胞肿瘤，伴有myc和bcl-2的易位。

手术中冷冻切片的病理检查。一般在临床到怀疑淋巴增生性疾病的情况下，不会选择手术中冷冻切片病理诊断来明确病变的性质。往往是在临床上的某个器官或者组织的占位性病变，但是在冰冻检查的过程中发现是、或者可能是淋巴增生性疾病。那么在这种情况下我们要注意的问题就是两个，第一要告知临床医生，这个可能是一个淋巴增生性疾病，避免临床上对这个组织或者器官的过度治疗，比如一些致残性的手术，如发生在喉的、乳腺的、前列腺的一些标本。另一个方面要告诉临床医生，尽可能再取一点组织，不要做冷冻检查，只进行常规的病理检查。这样的标本它的组织保存（包括蛋白和核酸保存）得比较好，可以满足后续的免疫组织化学染色、分子检测的需要。这两点是最重要的。大家看我们的一个病例，五十几岁的男性病人，颅内的占位病变。从冷冻检查来看是一个富于细胞的病变。高倍镜下看到这些细胞比较密集，细胞形态不太规则，有一定的异型性。那么它到底是一个胶质细胞肿瘤或者其他肿瘤、还是一个淋巴组织肿瘤呢？当你怀疑到淋巴组织肿瘤的时候，要给临床一个提示，刚才已经讲了的两个方面。那么后期的免疫组化染色提示这是一个发生在中枢神经系统、发生在颅内的大B细胞淋巴瘤。

接下来我们来看一看样本的标识。样本的标识要符合国内相关的行业规范和总则里面所提到的一些要求，现在比较重要的是要强调双标识，双标识的目的就是确保样本的唯一性和确保在标识的过程中不出现导致一些差错的发生。双标识应该贯穿在病理标本的整个过程中，从大标本到蜡块、到切片，都要进行双标识。可以作为双标识的信息有这样一些，包括患者的姓名、编号、住院号或者登记号以及患者的身份证号。一般来讲，用前面3个的几率是比较高的。

接下来我们看看样本的处理和制片。样本的处理遵循的是总则所讲的一般原则，固定用的是4%的中性甲醛溶液，样本与固定液的体积比要求是1:4，固定液的量应该是样本量的4到10倍。固定时间根据标本的大小不同要求6-48个小时，至少要有6个小时。对于淋巴增生性疾病的标本，由于它的细胞成分比较丰富，间质成分比较少，切片宜薄不宜厚。整个制片过程的质量控制和总则的要求是完全一样的。对于淋巴增生性疾病的诊断，我们还是要强调高质量的HE切片是非常重要的依据。在高质量的HE切片，可以很好地观察病变组织的形态、构象，比如这是一个反应性增生的淋巴结，我们可以看到淋巴滤泡的分布：滤泡、滤泡间区、窦和索的分布情况。在高倍镜下可以很清楚地观察到细胞的细微形态，包括细胞核、细胞质、核的整个的结构等等，这是非常重要的。再看这样一些质量很差的HE切片：有一些刀痕；有一些组织的缺失；染色的情况也很差、不透明，就是我们经常说的“打不穿”，这就很影响淋巴组织疾病的诊断。

再接下来我们来看看病理检查申请表。病理检查申请表对于淋巴增生性疾病除了满足共性方面的要求而外，需要提供跟淋巴增生性疾病相关的一些临床和实验室检查以及影像学检查的结果，包括血象即血常规、骨髓穿刺或者是活检的结果、骨髓或者外周血的流式细胞术检查结果、影像学、还有其它比如分子检查的结果。每个单位的病理科都有根据自己科室的情况设计的病理诊断申请表。

前面我们讲了样本的制备，接下来我们来看看淋巴瘤的规范化病理诊断方面的内容。淋巴组织肿瘤的病理诊断主要是要通过对病变组织的活检来确定诊断，所以对于淋巴组织肿瘤的病理活检和组织学诊断及分型要采用国内或国外公认的或者是通用的标准，这个是比较重要的。从第4版的WHO分类就已经提出了淋巴组织肿瘤病理诊断的四结合原则，也就是形态学、免疫表型、分子和细胞遗传学以及临床表现的四结合。对于我们一些基层的医院，如果不具备淋巴增生性疾病的病理诊断条件的情况下，最好就是送上级医院，或者送有条件的医院进行会诊。我们看到的这个是WHO关于淋巴造血组织肿瘤的分型的蓝皮书。这是2008版、第四版的蓝皮书。在所有的WHO分类里面，淋巴组织肿瘤病理诊断的蓝皮书在国际上的接受度是比较高的，无论是国内还是国外、无论是临床还是病理医生。这是2016年、去年才发表在《Blood》杂志上发表的一个修订的WHO关于淋巴组织肿瘤的分类，而第五版的分类也许在今年就要出台。这就是我们讲到的淋巴组织肿瘤病理诊断的四结合原则。形态学包括一般的、比如淋巴瘤或者淋巴增生性病变的基本病理病变，也包括发生在不同的器官组织和不同组织类型的淋巴瘤表现出来的一些特殊的形态学特征。免疫表型我们可以通过免疫组织化学染色、免疫细胞化学以及流式细胞术这样的一些检测手段来进行。分子遗传学方面可以做免疫球蛋白或者T细胞受体的克隆性性分析，也可以做一些特殊的基因异常的检测，如通过FISH平台或者是PCR-best这样一些方法来进行检测。临床表现仍然是淋巴增生性疾病的共性表现，比如发生在淋巴结表现为局部淋巴结的无痛性进行性肿大；发生在不同的器官和组织的淋巴增生性疾病有其个性的表现，这也是我们需要掌握的一些内容。

首先，我们来看一看形态学方面的观察。形态学方面观察对于病理诊断是非常重要的。实际上不光是淋巴增生性疾病，所有的疾病形态学观察都是病理诊断的第一步，对于淋巴增生性疾病尤为重要。这样的形态学观察可以提供或者是帮助我们发现某一些淋巴瘤的组织学类型的有用的、或者是有价值的、或者有参考价值的线索，同时也是我们选择辅助检查的一个非常重要的依据。比如说选择免疫组织化学染色，选择哪样的一些抗体、选择哪样一组抗体，都是基于形态学的观察来进行的。这样的一些辅助检查完成以后，最后我们要整合，和形态学的观察要结合起来对这个肿瘤进行诊断和分析，准确地解读辅助检查结果也离不开形态学。所以说形态学观察和分析，不但能够为淋巴瘤的诊断提供重要的线索，而且也是通向正确诊断的一个有效途径。我们看一看形态学观察要观察哪些方面的内容。形态学观察我们要观察3个方面的内容。1.肿瘤细胞的生长方式，到底是结节性的、弥漫性的、间区的或者是混合性的生长。2.肿瘤细胞的形态、细胞的大、小、细胞的异型性的情况，还有这些增生和浸润细胞的一致性情况，是单形性的、还是多形性的。3.伴随病变。这个肿瘤是不是伴随有出血、是不是伴随有坏死、伴有纤维化或者其它的一些改变。这是我们要观察的一个内容。首先来看一看，这是一个淋巴结的切除活检样本，在低倍镜下，我们可以看到这个病变形成了一个境界不是那么清楚的、有一些模糊的结节样的结构，这是一个构象；这个也是一个淋巴瘤，我们看到这些肿瘤细胞是呈弥漫性的增生和浸润，没有什么特别的构象；这个我们看到也是肿瘤细胞呈这种弥漫性增生和浸润，但是这些肿瘤细胞之间有一些组织细胞成分而形成了所谓的“star sky”，也就是星空现象。观察构象是第一个方面，第二方面我们就要观察细胞的大小。细胞的大小主要是参照两个方面，一个是肿胀的血管内皮细胞，还有一个是组织细胞的细胞核，大概是10μm左右。比肿胀的血管内皮细胞或者是组织细胞的细胞核小的就是小型，一般我们说的小型大概是7μm左右、7-8μm。这是一个慢性淋巴细胞性白血病的病变；这个是大细胞型，是一个最常见淋巴瘤类型，即弥漫性大B细胞淋巴瘤的肿瘤细胞，都是中心母细胞样的细胞，“centroblast-like”，这些细胞的核是圆形或卵圆形的，核染色质是拉空的，可以看到1-3个核仁，多数是贴着核膜；这个也是一个大B细胞淋巴瘤的病例，我们除了看到一些中等大小的或者中等偏大的细胞，还看到散在分布的一些异形细胞。这些细胞的体积很大，这是瘤巨细胞。在所有的非霍奇金淋巴瘤里面，最容易看到瘤巨细胞的就是弥漫大B细胞淋巴瘤。这个大家一看就知道是一个经典型霍奇金淋巴瘤的病例，这个肿瘤的特点就是在背景里面有大量的非肿瘤性的细胞成分：一些小淋巴细胞、组织细胞、大量的嗜酸性粒细胞，而肿瘤细胞是散在分布于病变组织中。这个地方可以看到肿瘤细胞的一个病理性分裂。这是它的细胞形态。在某些淋巴瘤我们也可以看到这种很典型的、叫做血管中心性浸润的情况。血管中心性浸润在很多淋巴瘤都可以出现，包括T细胞的、B细胞的以及NK细胞的一些肿瘤。淋巴上皮病变也常常是一些黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的一个常见的形态学表现，它表现为肿瘤细胞在粘膜内的灶性聚集性浸润，同时有粘膜或者是上皮的破坏，这样的一个形态学改变我们通过CK的免疫组织化学染色就可以很好地勾勒出这种上皮的残缺和淋巴细胞的浸润情况。这些我们可以看到是肿瘤细胞在血管内的分布情况；这个是在肝脾T细胞淋巴瘤里，肿瘤细胞在肝窦里面分布的情况。第三个方面的观察就是伴随病变。我们在淋巴瘤经常可以看到有不同程度的坏死改变；这个呈地图样的坏死；这是一个伴随病变，是一个浆细胞的肿瘤，看到有一个血湖，就是“blood-lake”；淀粉样变在B细胞的肿瘤和浆细胞的肿瘤里我们经常会遇到，这是一例浆细胞骨髓瘤的尸体解剖病例；这是胰腺的一个组织切片，我们看到胰腺小叶的结构还是比较清楚，在胰腺的间质里面、血管壁上和血管周围可以看到刚果红染色呈橘红色的物质，同时也可以看到这样一些红染的无定形物质，周围有多核巨细胞的浸润，形成一个异物肉芽肿的反应。这种淀粉样变我们通过刚果红染色是要在偏光显微镜下来进行观察它到底是不是阳性。在偏光显微镜下观察呈这种所谓的苹果绿色“apple green”的，就提示是刚果红染色阳性。

辅助检查。实际上在淋巴增生性疾病里面，有这么多的辅助检查可以用，但是最常用的还是免疫组织化学染色，其次是基因重排检测，这是用的最多的。我们首先来看一看免疫组织化学染色。免疫组织化学染色已经是淋巴组织肿瘤的病理诊断和分型必不可少的一个手段了。但是在免疫组织化学染色抗体的选择里面，我们特别要注意是要选择一组抗体，这一组抗体包括了涉及到诊断和鉴别诊断相关的一些内容。当然，免疫组化染色的质量控制是非常重要的，要保证免疫组化染色的质量，有效的质控是不可或缺的。免疫组化染色在淋巴组织肿瘤诊断中的应用主要是有这么几个方面。1.可以帮助我们明确或者是了解这个肿瘤细胞的属性，即这肿瘤细胞到底是哪些淋巴细胞来的，是T吗、B吗、NK吗或者其他的一些细胞。2.可以帮助我们了解肿瘤细胞所处的分化阶段，比如前体细胞的一些肿瘤常常会表达CD34、CD99、TdT这样一些标记。3.帮助我们了解特征性的遗传学改变，比如滤泡性淋巴瘤会出现bcl-2的高表达，套细胞淋巴瘤会出现cyclinD1的高表达。4.有助于我们区别是一个淋巴瘤还是一个反应性淋巴组织增生。这主要是在淋巴结的滤泡增生和滤泡性淋巴瘤的区别中，bcl-2染色在其中有非常重要的作用。5.指导分子靶向治疗。大家知道美罗华对于CD20（阳性B细胞淋巴瘤的靶向治疗作用）。这是一个B细胞的肿瘤，CD20染色是细胞膜的线性阳性反应；这个是一个浆细胞瘤，做的是免疫球蛋白轻链的染色，从染色结构来看，这边是κ，这边是λ，可以看到是κ轻链的绝对限制的一个染色，提示有克隆性的增生；这个就是一个前体淋巴细胞的肿瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤，这个肿瘤细胞表达TdT，要注意的是实际上不光淋巴母细胞性淋巴瘤表达TdT，还有其它的一些(包括髓系的)肿瘤也可以表达TdT；这个是一个淋巴组织的结节状增生，那么它到底是一个滤泡性淋巴瘤呢，还是一个滤泡的反应性增生？我们可以通过bcl-2染色来帮助我们进行区别：当是一个肿瘤性的滤泡的时候，我们看到结节内或者滤泡内这些细胞都表达bcl-2的抗原，而反应性增生的滤泡的生发中心这些细胞bcl-2是不表达的，也就是bcl-2阴性，而周围的套区和边缘区的细胞表达bcl-2，所以形成两个完全不同的模式：这个是滤泡性淋巴瘤的模式，这个是反应滤泡增生的模式。在免疫组化染色结果的解读过程中，我们需要注意的问题就是，一要了解所选择的这个抗体的表达谱的情况、阳性信号的定位，这个是非常重要的。二要了解这样的一些抗体的免疫组织化学染色在所要观察的那些细胞的定位情况。这是两个很重要的因素。我们也推荐了一些常见的淋巴组织肿瘤常用的一些抗体组合，大家在日常工作中可以参考。

我们综合起来看一下——比如以最常见的大B细胞淋巴瘤为例——我们对于淋巴瘤的综合病理诊断的过程。我们通过活检的样本了解到或者是获得了这个线索，觉得是一个非霍奇金淋巴瘤或者是一个大细胞型的淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤的可能性大。那么在这种情况下，我们选择了一组抗体，这组抗体涉及到细胞的属性，比如CD20；然后涉及到它的免疫分型，现在比较通用的、操作性比较好的还是汉斯分型的3个标记：CD10、bcl-6和MUM-1；涉及到细胞的增殖活性Ki-67，还有预后相关标记，每个医院、每个地方有一些不同，但是对于大B细胞淋巴瘤最重要的是：我们要注意bcl-2和myc蛋白的表达。在修订的WHO分类里面已经明确提出了对于大B细胞淋巴瘤的病理诊断里，我们需要回答的一个问题就是它是不是双表达的问题，所以bcl-2和myc是必须选择的。再一方面，我们对所有的大B细胞淋巴瘤都建议或者推荐做EB病毒原位杂交的检测。通过这样一个工作，我们也发现实际上EB病毒阳性的大B细胞淋巴瘤远远比我们想象的多。

在免疫表型检测的基础上，我们要选择一部分病例做进一步的基因检测，这中间比较重要的一些提示线索有这么几个：1.高增殖指数，即肿瘤细胞增殖指数大于80%，这是我们推荐的一个“cut off”值；2.肿瘤细胞有myc易位、有myc的高表达，或者是c-myc和bcl-2的双表达，这样的一些因素建议要做分子检测。小B细胞淋巴淋巴瘤也是如此。根据形态学的观察，我们选择了一组panel，涉及到了小B细胞肿瘤的组织学亚型的诊断，必要的时候我们要进行基因检测。对于滤泡性淋巴瘤，我们做bcl-2易位的检测，百分之八十几是bcl-2的易位，但还有百分之十几的是bcl-6的易位。 CyclinD1是CCND基因易位以后导致cyclinD-1蛋白的过度表达，这是套细胞淋巴瘤的特征，但是有些套细胞淋巴瘤可能不表达cyclinD-1而可能是cyclinD-2的易位，所以这个是我们在这类肿瘤诊断中要注意的问题。MALToma，黏膜相关淋巴组织淋巴瘤。对于胃的黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的诊断，现在推荐都应该建议病人做API2/MALT1易位的检测，而对于慢性淋巴细胞白血病这类肿瘤，实际上基因检测跟诊断是没有关系的，主要是跟病人的治疗和临床的分层是有关系的，所以临床要求的话做的比较多。

免疫表型检测完了以后，我们看看基因重排的分析。基因重排分析我们要注意的主要是两个方面的问题，第一个方面的问题就是什么时候选择做基因重排检测，第二方面就是基因重排检测里面我们要注意的问题。首先来看什么时候需要进行基因检测。一般来说有这5种情况下需要做基因检测：一病变的活检组织很小，比如腔镜活检或者是钳夹活检、穿刺活检这样一些很小的组织，它的形态学信息很有限。二是一些混合性淋巴细胞增生病变，也就是形态学观察我们看到病变组织里面既有T、又有B细胞的一个混合性增生，单纯凭形态学或者形态学加免疫组化表型检测以后，仍然不是那么容易判定它的问题细胞成分的时候，我们需要借助于基因重排检测。三是皮肤的淋巴增生性疾病，我们也是经常需要做基因重排分析。四是怀疑为结外边缘区粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的病例也是需要的。最后是有一些病例经过免疫表型检测以后，我们观察到的这样一些问题细胞既不表达T细胞标记，也不表达B细胞标记，就是我们所说的“null cell”裸细胞，这种情况也是需要进行基因重排检测的。这是什么时候、或者哪些情况下需要进行基因重排检测。大概有10%到20%的淋巴增生性病例需要借助于基因重排检测帮助我们判定病变性质。在基因重拍检测选择了以后，结果出来我们对它分析的时候又需要注意一些问题，不是说基因重排检测阳性就一定提示它是一个肿瘤性的增生，这一点要特别明确。这些结果必须要整合：和形态学整合、和免疫表型整合，然后进行一个综合的分析。一般来讲有这么3个方面，一是免疫球蛋白基因重排并不仅限于B细胞，T细胞受体基因重排并不仅限于T细胞，不是这么个情况。我们看到有些T细胞的淋巴瘤可以出现免疫球蛋白的基因重排，但是它有一定提示。如果这个病例只有免疫球蛋白的基因重排，或者只有T细胞受体基因重排，它可能提示是一个肿瘤细胞系。但是像刚才我们说的，如果同一个病里面既检测出了免疫球蛋白基因重排又检测出T细胞受体的时候，只能说明这里面这两类细胞的克隆性增生。二是基因重排结果的解释。对于小组织特别是钳夹组织、穿刺组织这样的病例，做基因重排分析的时候呢，也就是我们可能会遇到这种情况，比如一个胃镜的活检或者肠镜活检。它是一个B细胞的优势增生，我们看到里面大量的B细胞，背景里面还是有一些少数的T细胞成分。但由于这个T成分数量太少了，没有办法形成一个多克隆的背景的时候，这样的一个标本做检查的时候可能就会出现除了检测出免疫球蛋白基因重排，同时还会检测出T细胞的克隆性重排。这种它可能是一个类似于克隆或者寡克隆的PCR的产物，这个时候会干扰。但是这样的一个结果必须得结合形态学、结合免疫表型的分析，然后综合来判断，这个就非常重要。当然，分子检测质量控制也是保证检测的准确性的一个非常关键的因素，是不容忽视的。

这是我们的基于PCR的一个分子检测平台；荧光原位杂交也是在淋巴瘤的诊断中经常使用的一个技术，这是我们的荧光原位杂交平台，它主要是两个方面构成，一个方面就是实验操作平台，另外一方面就是结果的分析和观察的平台、一个观察的系统。荧光原位杂交技术、即FISH技术在淋巴增生性疾病诊断中的应用主要是有这么几个方面：一是帮助我们确定一些有特征性的遗传性改变的淋巴瘤的类型。比如Burkitt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、ALK阳性大细胞淋巴瘤等等。二是协助诊断一些特殊类型的淋巴瘤。现在比较多的主要还是这种在修订的WHO分类里面提到的所谓的高级别B细胞淋巴瘤伴有c-myc或bcl-2或者还有bcl-6易位的这样一些肿瘤的诊断。三是跟治疗和预后相关的，我们用的比较多的，比如说对于小淋巴细胞性的淋巴瘤或者是慢性淋巴细胞白血病的一个套餐检测。这样的一些细胞遗传学方面的改变或者是这样的一些基因的异常，跟这个肿瘤的分层、治疗是密切相关的，还有浆细胞肿瘤等等。

以大B细胞淋巴瘤为例——因为大B细胞淋巴瘤是最常见的非霍奇金淋巴瘤的类型——什么时候我们需要做FISH呢？也是有3种情况：临床表现为一个侵袭性的肿瘤，比如说高IPI指数；或者原发中枢神经系统淋巴瘤；或者伴有骨髓累及。从病理方面来看主要基于3个方面，一是这个肿瘤的形态学，二是这个肿瘤的高增殖活性，Ki-67指数大于80%，三是肿瘤表达c-myc蛋白或者c-myc、bcl-2蛋白的双表达。这些都提示需要做FISH即荧光原位杂交检测。尽管现在的一些研究认为，对于大B细胞淋巴瘤而言，双表达和双打击二者是互不相干的，但是我们还是发现有部分病例既是一个双表达淋巴瘤，同时也存在着双打击或者三打击的情况，所以说还是需要做的。从临床角度来看的话就是流式细胞术检查，肿瘤细胞是CD38bright和CD20dim、也就是C20弱表达的，这样的一些肿瘤也是建议做FISH检测的。

下面是病原学检测。对于淋巴增生性疾病的病理诊断我们用的最多的病原检测就是EB病毒感染的检测，而采用的方法可以是EB病毒的EBER，即EB病毒编码小分子RNA的原位杂交，也可以是采用EB病毒的蛋白LMP1的检测。但是从准确性来讲，或者说作为金标准来讲，EBER原位杂交应该是一个首选，其次就是对于幽门螺杆菌的观察。我们在普通HE染色切片上就可以进行观察，也可以采用特殊染色，比如WS或者是姬母萨染色，还有免疫组化染色也可以进行。其它的就是HBV、HCV的观察，我们可以通过免疫组化来进行。

再谈一下院际会诊的病理诊断，因为对于淋巴增生性疾病，它本身是有相当难度的，对于基层医院可能又不具备一些比较重要的辅助检查条件，比如即便有免疫组织化学染色，但是涉及到淋巴瘤诊断的这样一些抗体组合可能不是那么全。在这种情况下，院际会诊是解决淋巴增生性疾病的一些疑难病例的病理诊断的一个非常有效的途径，所以我们也是很强烈地推荐在不具备条件或者不完全具备条件的这样一些机构或者是医院，对于这些疑难的淋巴组织增生性疾病，尽量地去选择会诊。选择会诊的时候我们需要注意哪些问题、即需要提供哪些会诊相关的材料呢？主要有这么几个方面：一是HE切片，但如果提供了蜡块的话，可以不提供切片，接受会诊的单位可以自制切片。二就是各种辅助检查的结果，包括前面的免疫组化、原位杂交等等。会诊的病例材料就是蜡块或者是足量的白片。我们还是推荐使用蜡块。三是相应的文书记录，比如原始的病理诊断的情况，或者是相关的复印件。尽量提供一些临床的资料，我们知道这些临床资料对淋巴增生性疾病的病理诊断和分析也是非常重要的，包括详细的病史、出院小结、病情简介等等，还有一些实验室检查结果。对于皮肤病变最好有病变的照片。对于院际会诊我们需要提供这样的一些材料。这样的原始切片和借用的蜡块，在会诊结束以后都会归还给送会诊的单位，所以这个大家不必担心。会诊意见也是供各个会诊单位、包括患者或者家属参考。

最后我们就来看看病理报告的内容和格式问题。我们前面讲了淋巴组织肿瘤的病理诊断是一个四结合的原则：病理形态学、免疫表型、遗传学以及临床表现的一个综合分析，那么病理报告的内容上就有两个方面：一是共性的内容，即和所有的病理诊断报告的内容是类似的，比如患者的基本信息。二是个性方面的内容，就是跟淋巴组织肿瘤或者淋巴组织疾病相关的一些信息，因为淋巴组织疾病的病理诊断和其它的有些不同，就是很多的辅助检查结果都是为它的病理诊断和组织分型服务的，所以这样的结果都是需要整合到病理诊断报告里面去的。其它需要整合到报告里面的信息还可以有诊断医生的评论，比如一些很少见的疾病或者可能临床医生不是那么熟悉的，我们会有一些comment，甚至还可能会提供一些主要的或者是重要的参考文献和书籍，这些都可以作为报告的一部分。

最后举个例子。这是一个43岁的女性病人，是颈部包块的切除活检。组织学我们看到的这个淋巴结，结构是完全看不到了，看到的是一些中等偏大的异型淋巴样细胞的弥漫性增生和浸润。高倍下我们看到这样的一些细胞，形态基本上是一些中心母细胞样的细胞，细胞的一致性比较好，而且看到有比较多的核分裂以及部分细胞凋亡的情况。免疫表型检测，我们选择细胞属性相关的抗原CD20，这些细胞是阳性的，而背景的小淋巴细胞是CD3ε阳性的。汉斯分型相关的3个标记bcl-6和MUM-1阳性提示是一个活化B细胞来源的肿瘤。Ki-67指数比较高，80%。其他预后相关的标记我们做的有CD5，肿瘤细胞有一些弱的阳性反应，而强的反应是反应性T细胞成分。NF-kb胞浆的阳性是不能判断为阳性的，必须要是核的阳性才有意义。另外两个很重要的就是bcl-2和myc蛋白的表达情况，bcl-2超过了50%，myc超过了40%，所以这个又提示是一个c-myc和bcl-2和双表达的肿瘤。Tp53蛋白的表达是阳性的，其它的我们也做了cyclinD1，这是一个阴性的，它的内对照组织细胞和血管内皮细胞是阳性的，EBER是阴性。最后结合形态学、免疫组织化学化学染色的结果和一般原则等等，我们综合出了这个病理诊断，包括了这个肿瘤的组织学类型、免疫学亚型和一些要建议的工作。所以病理报告的格式我们还是推荐这种条目式的或者是框架式的报告，很清楚，临床医生也很容易捕捉到他所关心的一些信息。这样的报告包括了病变的部位、样本的类型、必要的时候可以做组织学的描述、病理诊断和组织学分型。这些辅助检查的结果都整合在里面了。免疫组织化学染色提示是非生发中心B细胞来源的肿瘤。然后，这是预后相关的一些标记的表达的情况和它的结果分析：它是一个bcl-2和myc蛋白双表达的肿瘤。这样的一个肿瘤，高增殖活性，有myc和bcl-2的双表达，所以我们要建议他做FISH，做基因分析，下面就是一个建议，建议做荧光原位杂交检测，以除外特殊类型，主要是高级别的大B细胞淋巴瘤伴myc或bcl-2/bcl6易位，这样的肿瘤它对一般的大B细胞淋巴瘤治疗效果是不好的，这是必须给临床提供的一些信息。

l 对于淋巴增生性疾病的病理诊断，（第一个方面）一张好的HE切片是非常重要的，而一张好的HE切片的得来离不开标本的及时切取固定和整个的病理技术过程。对于淋巴增生性疾病的病理切片，因为它的细胞比较丰富，我们再次强调切片宜薄不宜厚。

l 第二个方面就是在我们的实际工作中，我们都知道了淋巴增生性疾病病理诊断的四结合的原则，但是怎么样能够更好地使用好这个四结合的原则是更为关键的。

l 第三个方面的就是免疫组化染色的抗体选择我们要把握的基本原则。首先它是基于形态学；二要考虑到病理诊断和鉴别诊断方面的一些内容，同时要兼顾卫生经济学方面问题，也就是说要给病人省钱。

l 最后就是对于一些疑难的淋巴组织增生性疾病的病理诊断，院际会诊是一个非常有效的途径。