新型人工生物补片作为主动脉瓣替代材料的可行性

新型人工生物补片作为主动脉瓣替代材料的可行性

刘剑州，刘兴荣，张超纪，马国涛，李晓凤，苗齐

中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院心外科，北京100730

【摘要】目的探讨胶原膜与碱性成纤维细胞生长因子 (base fibroblast growth factor，bFGF)特异结合的人工生物补片作为主动脉瓣膜替代材料的可行性。方法健康杂种家犬10只随机分为对照组和实验组，每组5只，静脉全麻、腹主动脉阻断下分别使用仅浸泡磷酸盐缓冲液的胶原膜材料或特异结合bFGF的胶原膜材料作为人工瓣膜行腹主动脉腔内移植。于术后3个月利用超声心动图对人工瓣膜的功能进行评价，于术后6个月取材观察人工瓣膜状况。结果术后3个月超声心动图检测人工瓣膜的功能在对照组和实验组之间无差别，术后6个月对照组及实验组犬腹主动脉腔内的人工瓣膜均降解。结论胶原膜与bFGF特异结合的人工生物补片在体内的降解速率较快，目前尚不能作为主动脉瓣膜良好的替代材料。

【关键词】人工生物补片;心脏瓣膜病;碱性成纤维细胞生长因子;胶原膜

Med J PUMCH，2015，6(4):271－274

心脏瓣膜病是由于炎症、黏液样变性、退行性改变、先天性畸形、缺血性坏死、创伤等原因引起的单个或多个瓣膜 (包括瓣叶、瓣环、腱索或者乳头肌)的功能或结构异常，导致瓣膜狭窄和 (或)关闭不全。心室和主、肺动脉根部严重扩张也可产生相应房室瓣和半月瓣的相对性关闭不全。瓣膜置换手术是其治疗的主要方法。目前临床上应用的人工瓣膜有机械瓣膜和生物瓣膜两种，均可以有效改善血流动力学，但都存在一些缺陷［1-3］:机械瓣膜需终身抗凝，易致出血、血栓栓塞及感染等;生物瓣膜主要来源于异种心包组织 (猪心包、牛心包)，而这些心包组织通常通过脱细胞处理以去除异物反应，经戊二醛处理的脱细胞过程使心包组织的胶原纤维交联到一起从而增加组织强度，延缓其降解速率，但是该过程亦引起钙化反应并退行性变，长期使用会发生增厚、卷曲等病理改变，10～15年后需再次手术。

利用人工生物补片作为新型的生物瓣膜材料越来越受到关注。本研究组在前期实验中寻找到的七肽片段“TKKTLRT”(collagen-binding domain，CBD)能够特异性结合Ⅰ型胶原［4-5］，将这段肽段偶联到碱性成纤维细胞生长因子 (base fibroblast growth factor，bFGF)上，形成一种融合蛋白CBD-bFGF，其能与Ⅰ型胶原构成的胶原膜特异结合而构建一种新型人工生物补片。

本研究将特异结合了bFGF的胶原膜移植于动物模型犬的主动脉腔内，观察其组织相容性、生物功能及钙化程度，探讨此种人工生物补片作为主动脉瓣膜替代材料的可行性，从而为临床寻求一种应用于瓣膜外科领域的新型抗衰败及良好组织相容性的人工生物瓣膜材料提供可能。

材料和方法

实验动物

健康杂种家犬10只 (由北京协和医院动物实验中心提供)，雌雄不拘，体重18～23 kg。所有动物使用均得到动物伦理委员会的批准。实验前禁食水8 h，所有实验动物术前及术后均在北京协和医院动物实验中心饲养。将实验动物随机分为2组，每组5只:(1)对照组:建模后移植的胶原膜材料只进行了磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline，PBS)浸泡，未与目的蛋白结合;(2)实验组:建模后移植结合了CBD-bFGF蛋白的胶原膜材料。

实验方法

胶原膜预处理:将实验用胶原膜修剪成10 mm× 10 mm大小的方形，厚度为0.8 mm，经60钴照射灭菌;将CBD-bFGF配成0.5 nmol/80 μl，加载于胶原膜片上(总量为0.5 nmol)，对照组仅加载PBS(通过预实验测定胶原膜吸水量为80 μl/片);制作单叶人工瓣膜备用。

腹主动脉阻断下行胶原膜材料腹主动脉内移植:动物取仰卧位，固定四肢。右耳中静脉建立静脉通路，心电监护，袖带间断监测右前肢、右后肢血压，犬尾监测脉搏血氧饱和度。行气管插管建立人工通气，静脉通路给予丙泊酚6 mg/kg泵入用以麻醉维持，给予生理盐水100 ml+头孢呋辛钠0.75 g静脉滴注。腹主动脉阻断前给予肝素 (1 mg/kg);消毒、铺单，腹中线中下2/3开腹，于肾动脉以下、髂总动脉分叉以上位置分离腹主动脉，两端套绕丝带。充分肝素化后，阻断腹主动脉。横向切开腹主动脉，进行人工瓣膜移植。腹主动脉阻断后，7-0 Prolene线将单叶人工瓣膜吻合于血管壁腔内侧，模拟心脏瓣膜的形态，关闭主动脉切口。排气后打结，开放阻断钳，检查吻合情况，止血，关腹。动物麻醉清醒、恢复自主呼吸后可拔除气管插管，右侧卧位，鼓励动物尽早立行。

术后瓣膜形态及功能评价:在手术后3个月对动物进行超声心动图检测，评价植入人工瓣膜的形态及血流动力学指标，并于手术后6个月取出腹主动脉，观察植入的人工瓣膜状况。

结果

利用胶原膜制备的人工瓣膜移植于腹主动脉腔内

本实验将胶原膜材料制作成单个瓣膜的形状移植于犬腹主动脉腔内，所有实验动物均未出现血栓形成及死亡 (图1)。

超声心动图对人工瓣膜的功能评价

术后3个月，对移植了人工瓣膜的犬腹主动脉进行超声心动图检测。对照组及实验组均可见部分植入的人工瓣膜，且瓣膜顺血流方向贴附于腹主动脉的管壁，未见狭窄及梗阻，亦未影响血流动力学，两组间无显著差异 (图2)。

人工瓣膜于植入的腹主动脉腔内逐渐降解

术后6个月时处死实验动物，再次打开腹主动脉腔，无论是对照组还是实验组，在手术缝合部位肉眼均未见任何植入的人工瓣膜，提示已降解 (图3)。

图1犬腹主动脉手术模型的建立及人工瓣膜移植于腹主动脉

A.术中游离腹主动脉;B.剪开腹主动脉，并将功能材料缝合到其壁上;C.腹主动脉缝合完毕

图2超声心动图检测犬腹主动脉腔内植入的人工瓣膜形态

A.血管纵切面，虚线以下示部分人工瓣膜;B.血管横切面，箭头示部分人工瓣膜

图3植入6个月后的犬腹主动脉中未见人工瓣膜，提示其
在腔内已降解

A.腹主动脉外观图;B.腹主动脉切开后剖面图

讨论

作为FGF家族主要成员之一的bFGF是一种来源于中胚层及神经外胚层的细胞因子，具有多种生物活性，在促血管生成、创伤愈合和组织损伤修复过程中作用巨大［6-9］:bFGF能够改善细胞生长的微环境，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成;能够促进成纤维细胞的生长发育，不断以新的细胞取代老化细胞;刺激肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，缩短创伤愈合时间以及减少瘢痕组织形成;还可调节胶原降解及更新，减缓组织退行性变。但bFGF为重组蛋白，使用时易降解，半衰期短，并且其生物活性发挥具有剂量依赖性。传统的将生长因子结合到生物材料上的常用方法是将因子简单地吸附在材料上，这种方法存在着很大不足:在材料移植到体内后，由于体液的浸润和流动往往造成生长因子的扩散，不仅扩散的细胞因子会给机体带来潜在的风险，而且材料上因子浓度的降低会导致修复效果有限。Lee等［10］发现bFGF结合于可降解的高分子物质构成一种缓释系统应用于肝细胞移植时，可显著提高支架材料的血管化率并促进肝细胞的趋化生长。另一研究显示，bFGF与多孔藻酸盐及聚羟基乙酸微粒形成缓释微球可控制bFGF的释放频率，并且释放后的bFGF依然具有良好的生物学活性，体外可以刺激心肌母细胞的增殖，体内可加速移植材料的血管化［11］。本研究合作单位在前期的实验中寻找到一小段七肽片段“TKKTLRT”能够特异性结合I型胶原，将这段肽段偶联到血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)上，构建了一种融合蛋白CBD-VEGF。这种融合蛋白同时在体内和体外都可以发挥正常的生物学活性，与胶原膜能特异性结合，以持续释放的方式发挥作用，并能有效改善心肌损伤后的心功能［4-5］。本研究在此基础上将构建成功的CBD-bFGF与胶原膜特异性结合作为一种新型的人工生物瓣膜材料移植于犬腹主动脉腔内。

本研究结果显示，人工生物瓣膜移植于犬腹主动脉腔内术后3个月行超声心电图检查时可见各组瓣膜均顺血流方向贴附于腹主动脉的管壁，未见狭窄及梗阻，未影响血液动力学;术后6个月行各组实验动物取材显示腹主动脉腔内手术缝合部位未见任何植入的人工瓣膜组织，说明已完全降解。由此表明，CBD-bFGF功能胶原膜材料在体内降解速率较快，目前尚不能作为主动脉瓣膜良好的替代材料。本研究选取犬腹主动脉作为人工瓣膜的移植区，其血流动力学与心脏瓣膜区的血流动力学存在一定的差异，对人工瓣膜的降解是否具有影响还有待进一步的实验验证。另外，如何平衡胶原材料在体内的降解速率与组织再生及钙化反应的关系亦是今后探索主动脉瓣膜替代材料的关键。

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Feasibility of New Artificial Biologic Patch as Aortic Valve Replacement

LIU Jian-zhou，LIU Xing-rong，ZHANG Chao-ji，MA Guo-tao，LI Xiao-feng，MIAO Qi

Department of Cardiac Surgery，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

【Abstract】ObjectiveTo study the feasibility of artificial biologic patch made of collagen membranes loaded with collagen-binding base fibroblast growth factor(bFGF)as aortic valve replacement．Methods Ten healthy mongrel dogs were randomly divided into control group and experiment group(both n=5)．Abdominal aorta replacement using artificial biologic patch made of collagen membranes loaded with collagen-binding bFGF (experiment group)or soaked with phosphate buffered saline(control group)was performed under general anesthesia and abdominal aorta blockage．Three months after the surgery，echocardiography was performed to evaluate the function of the artificial valve．Six months after the surgery，the condition of the artificial valve transplanted in the abdominal aorta was observed．Results No significant difference was found between the experiment group and the control group in function of the artificial valve evaluated by echocardiography 3 months after the surgery．The artificial valves entirely degraded 6 months after implanted into the abdominal aorta in both groups．Conclusion The degradation of artificial biologic patch made of collagen membrane loaded with collagen-binding bFGF in vivo is so fast that it is not a good alternative for replacement of the aortic valve．

【Key words】artificial biologic valve;heart valve disease;base fibroblast growth factor;collagen membrane

Corresponding author：MIAO Qi Tel:[phone]，E-mail:[e-mail]

【中图分类号】R605【

文献标志码：】A【

文章编号：】1674-9081(2015)04-0271-04

DOI：10.3969/j.issn.1674-9081.2015.04.007

(收稿日期：2014-10-13)

通信作者：苗齐电话:[phone]，E-mail:[e-mail]

基金项目：北京协和医院中青年基金 (pumch-2013-003)