肝细胞肝癌组织中FN和PTEN基因表达水平及意义

肝细胞肝癌组织中FN和PTEN基因表达水平及意义*

许桐林**，吴金柱，蔡卫华

（南通市第三人民医院普通外科，江苏 226006）

［摘要］目的：研究FN和PTEN基因在肝细胞肝癌中的表达情况，探讨其在肝细胞肝癌发生发展中的作用及意义。方法：应用荧光实时定量PCR方法，检测84例肝细胞肝癌及癌旁组织中FN蛋白、PTEN蛋白、mRNA表达情况。分析FN和PTEN基因表达及肝细胞肝癌的关系。结果：FN蛋白主要定位于肝癌细胞外基质中。FN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为79.76%，高于癌旁肝组织的阳性率9.52%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。PTEN蛋白明确定位于肝细胞胞质内。PTEN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为38.09%，明显低于癌旁肝组织的阳性率100%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。FN在合并癌栓，淋巴结转移，AFP阳性，肿瘤数目多发的肝癌组织中的表达高，而在不同分化程度及不同肿瘤直径的肝癌组织中表达差异无统计学意义；PTEN在低分化肝癌细胞，合并癌栓，AFP阳性，淋巴结转移，肿瘤直径≥2cm的肝癌组织中表达较低，而在不同肿瘤数目的肝癌组织中表达无统计学意义，PTEN蛋白表达与HBsAg无关，与组织学分级及转移有关。结论：肝癌组织中FN mRNA的表达量高于癌旁组织，而肝癌组织中PTEN mRNA的表达量低于癌旁组织，FN和PTEN基因可能与肝细胞肝癌的发生发展有关，其可能在肝癌的发生发展、侵袭转移中起一定的促进或抑制作用。

［关键词］肝细胞肝癌；抑癌基因纤黏连蛋白；张力蛋白同源基因蛋白；基因表达

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinomas，HCC）是消化系统最常见恶性肿瘤之一，南通地区发病率较高。最新研究发现，抑癌基因纤黏连蛋白（fibronectin，FN）以及张力蛋白同源基因蛋白（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）与肿瘤的发生、发展关系密切，在肝癌中的表达已成为目前焦点［1］。本研究应用荧光实时定量PCR方法，从定性及定量角度同步检测肝细胞肝癌及对应癌旁肝组织中FN蛋白、PTEN蛋白mRNA的表达情况，探讨其在肝细胞肝癌发生发展中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2014年7月—2015年7月期间本院手术切除的HCC癌组织及其癌旁组织新鲜标本84例，癌旁组织距肿瘤边缘＞2cm。男性61例，女性23例，年龄28～82岁，平均56.5岁，并且具有完整的临床病理资料。

1.2 试剂及仪器Step One Real-Time PCR System（ABI公司，美国）；Trizol（BBI公司，加拿大）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆转录（RT）试剂盒（roche公司，美国）；Fast EvaGreenqPCR Master Mix（roche公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计：在gene bank中查找并下载相关基因的mRNA序列及相关信息，本实验荧光定量PCR引物采用primer express2.0软件严格按照相关原则设计，Gapdh F：5′GAAGGTCGGAGTCAACGGAT 3′, Gapdh R：5′TGGAAGATGGTGATGGGATT′，FN-F：5′TGACTCGCTTTGACTTCACCAC 3′，FN-R：5′TCTCCTTCCTCGCTCAGTTCGT 3′，PTEN-F：5′ACACGACGGGAAGACAAGTT 3′，PTEN-R：5′TCCTCTGGTCCTGGTATGAAG 3′，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.2 提取RNA：将50～100mg冰冻组织研碎后匀浆，加1mL Trizol，转移至1.5mL EP管中，置室温5min。加入0.2mL氯仿，混匀15s，置室温2min。然后12 000r/min离心10min。将上清转移到另一干净的EP管中，加入0.5mL异丙醇，静置10min，然后12 000r/min离心10min，去上清，加入1mL 75%乙醇，7 500r/min离心5min，去上清，室温干燥沉淀，加入适量的DEPC-H2O溶解（650C促溶10～15min）［2］。

1.3.3 总RNA逆转录：在0.2mL RNA free EP管中加入0.1～5μg总RNA，Oligo（dT）18primer（0.5μg/ μL）1μL，加DEPC-H2O至12μL，65°C 5min；将EP管置冰上，按顺序加入以下反应组分，RiboLockTM核酸酶抑制剂（20u/μL）1μL，5×Reaction Buffer 4μL，10mM dNTP mix 2μL，RevertAidTM M-MμLV Reverse Transcriptase（200u/μL）1μL，混匀spin，42°C 1h，70℃10min，终止反应，获得的cDNA产物-20℃保存备用。

1.3.4 荧光实时定量PCR：对cDNA进行荧光定量PCR，每个样品设置3个重复。反应体系：SYBR Green Master Mix 10μL，forward primer 1μL，reverse primer 1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。扩增条件：95℃4min，94℃15s，60℃20s，72℃20s，并读取荧光值，循环45次，循环后设置55℃～90℃每隔0.3℃读荧光值生成熔解度曲线。反应完成后，选择PCR base line substracted模式进行数据分析和修正。在调整基线循环数和计算阈值后，得出Ct值，双⊿⊿法计算出样本的相对表达量［3］。

1.4 荧光实时定量PCR方法检测FN蛋白PTEN蛋白mRNA表达情况

1.4.1 TRIzol法提取RNA：将50-100mg冰冻组织研碎后匀浆，加1mL TRIzol，转移至1.5mL EP管中，置室温5min。加入0.2mL氯仿，混匀15秒，置室温2min。然后12 000r/min离心10min。将上清转移到另一干净的EP管中，加入0.5mL异丙醇，静置10min，然后12 000r/min离心10min，去上清，加入1mL 75%乙醇，7 500rpm离心5min，去上清，室温干燥沉淀，加入适量的DEPC-H2O溶解（65℃促溶10～15min）［2］。

1.4.2 组织总RNA逆转录：在0.2mL RNA free EP管中加入0.1～5μg总RNA，Oligo（dT）18primer（0.5μg/μL）1μL，加DEPC-H2O至12μL，65°C 5min；将EP管置冰上，按顺序加入以下反应组分，RiboLockTM核酸酶抑制剂（20u/μL）1μL，5×Reaction Buffer 4μL，10mmol/L dNTP mix 2μL，RevertAidTM M-MμLV Reverse Transcriptase（200u/μL）1μL，混匀spin，42°C 1h，70°C 10min，终止反应，获得的cDNA产物-20℃保存备用。

1.4.3 荧光实时定量PCR：对cDNA进行荧光定量PCR，每个样品设置3个重复。反应体系：SYBR Green Master Mix 10μL，forward primer 1μL，reverse primer 1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。扩增条件：95℃4min，94℃15s，60℃20s，72℃20s并读取荧光值，循环45次，循环后设置55℃～90℃每隔0.3℃读荧光值生成熔解度曲线。反应完成后，选择PCR base line substracted模式进行数据分析和修正。在调整基线循环数和计算阈值后，得出Ct值，双⊿⊿法计算出样本的相对表达量［3］。

1.5 免疫组化SP法检测FN和PTEN蛋白的表达收集手术病例标本蜡块，同一病例标本蜡块各切3张，厚度5μm，后脱蜡、水化组织切片；预处理组织切片；蒸馏水漂洗，置于TBS缓冲液中。阻断内源性过氧化物酶；蒸馏水漂洗，置于TBS缓冲液中10min；一抗孵育10～30min；TBS缓冲液漂洗10min；EnVision TM孵育10～30min；TBS缓冲液漂洗10min；色源底物溶液孵育10min；蒸馏水漂洗；复染及封片。评判标准：随机计数50个高倍镜中阳性细胞的百分比，阳性细胞数＜1%为0分，l%～30%为1分，31%～75%为2分，＞75%为3分，根据染色的深度记分：浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项指标相乘(0～9分)，记录染色结果，两项相乘分数0～4分者计阴性表达（-），5～9分者计阳性表达（+）。

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件统计数据。FN及PTEN蛋白计量资料以±s表示，采用t检验；FN及PTEN蛋白阳性率及与HCC临床病理特征的关系采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FN m RNA在肝癌和癌旁组织中的表达GAPDH和FN基因的扩增曲线均接近S型曲线，熔解曲线分析发现两个基因的PCR产物均呈较为锐利的单一峰，无杂峰。如图1～3。FN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为79.76%（67/84），高于癌旁肝组织的阳性率9.52%（8/84），FN mRNA在肝癌和癌旁组织中表达水平差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 PTEN mRNA在肝癌和癌旁组织中的表达GAPDH和PTEN基因的扩增曲线均接近S型曲线，熔解曲线分析发现两个基因的PCR产物均呈较为锐利的单一峰，无杂峰。如图4～6。PTEN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为38.09%（32/84），明显低于癌旁肝组织的阳性率100%（84/84），PTEN mRNA在肝癌和癌旁组织中表达水平，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 FN mRNA在肝癌和癌旁组织中扩增曲线图

图2 FN mRNA在肝癌和癌旁组织中熔解曲线图

图3 FN mRNA在肝癌和癌旁组织中表达水平

图4 PTEN mRNA在肝癌和癌旁组织中扩增曲线图

图5 PTEN mRNA在肝癌和癌旁组织中熔解曲线图

图6 PTEN mRNA在肝癌和癌旁组织中表达水平

2.3 FN、PTEN蛋白表达与临床病理因素关系FN在合并癌栓、淋巴结转移、AFP阳性、肿瘤多发的肝癌组织中的表达高，而在不同分化程度及不同直径的肝癌组织中表达差异无统计学意义；PTEN在低分化肝癌、合并癌栓、AFP阳性、淋巴结转移、肿瘤直径≥2cm的肝癌组织中表达较低，而在不同肿瘤数目的肝癌组织中表达无统计学意义，PTEN蛋白表达与HBsAg无关，与组织学分级及转移有关，见表1。

表1 FN及PTEN蛋白表达与HCC临床病理特征的关系

3 讨论

近年来发现FN及PTEN与恶性肿瘤的关系密切。FN在口腔鳞癌、前列腺癌等癌细胞中呈高表达，PTEN在肺癌、胃癌以及肾透明细胞癌等恶性肿瘤中呈低表达。为了进一步阐明FN及PTEN在肝细胞肝癌中的作用，本研究采用荧光实时定量PCR方法检测肝细胞肝癌组织及癌旁组织中FN及PTEN的表达。

FN主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞等合成，并分布其周围。FN在体内具有细胞间吸附和迁移、酪氨酸磷酸化、细胞骨架组装、肿瘤转移等多种作用及功能［4］。来源于上皮的肿瘤细胞FN蛋白和基膜FN蛋白出现缺失，使癌细胞粘附性下降，增加癌细胞逃脱机会，破坏基底膜从而发生浸润和转移。另有研究［5］表明，FN可以通过调节Bcl-2基因家族的表达发挥抗凋亡作用。本研究显示结示，FN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为79.76%，高于癌旁肝组织的阳性率9.52%，差异有统计学意义（P＜0.05）。通过免疫组化分析FN在肝细胞肝癌组织中的表达情况，显示在肝癌组织中高表达，且FN在合并癌栓，淋巴结转移，肿瘤数目多发的肝癌组织中的表达高，提示FN在肝癌的发生发展、侵袭转移中可能有一定的促进作用。

PTEN基因具有双特异性磷酸酶活性，是一种去磷酸化的抑癌基因，与3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）有着密切的关系［6］，其机制除了通过抑制P13K/Akt传导通路，使细胞停滞在Gl期或者促进细胞凋亡，还能通过抑制PTEN/ERK/MARK途径，使细胞生长分化减慢或停滞，并促使肿瘤细胞衰老或凋亡，从而抑制肿瘤生长，因此其表达缺失与肿瘤发生进展密切相关［7－8］。有研究发现PTEN在HCC中的杂合性缺失频率可达33%，其表达随肝癌组织学分级的降低及侵袭性的增高而下降，提示PTEN可能与HCC细胞的转移和浸润密切相关［9-10］，并提示HCC的发生发展与PTEN的缺失或者突变有着某种密切的关系［11］。小鼠实验表明，可能由于PTEN基因失活或蛋白表达降低，导致PAK磷酸化能力降低，从而降低细胞间的粘附能力，并增加了金属基质蛋白酶的表达，进一步促进癌细胞侵袭和转移［12］。本研究结果显示，PTEN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为38.09%，明显低于癌旁肝组织的阳性率100%，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明PTEN失活在肝细胞肝癌的发生发展、侵袭转移中可能起一定的抑制作用。PTEN蛋白在低分化肝癌细胞、合并癌栓、淋巴结转移、肿瘤直径≥2的肝癌组织中表达较低，而在不同肿瘤数目的肝癌组织中表达无统计学意义，PTEN蛋白表达与HBsAg无关，与组织学分级及转移有关。

［参考文献］

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The expression level and significance of FN and PTEN gene in hepatocellular carcinoma

XU Tonglin,WU Jinzhu,CAI Weihua
(Department of General surgery,the Third Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226010)

［Abstract］Objective:To study FN and PTEN gene expression in hepatocellular carcinoma and to explore its role in the development of hepatocellular carcinoma.Methods:The expression of PTEN protein mRNA in 84 cases of hepatocellular carcinoma and corresponding adjacent tissues was detected by real-time fluorescence quantitative PCR method.Analysis of FN and PTEN gene expression and the relationship between hepatocellular carcinoma and hepatocellular carcinoma.Results:FN protein was mainly localized in the extracellular matrix of liver cancer.The positive rate of mRNA FN in hepatocellular carcinoma was 79.76%(67/84),higher than the positive rate of 9.52%(8/84),and the difference was statistically significant(P＜0.05).PTEN protein was localized in the cytoplasm of hepatocytes.The positive rate of mRNA PTEN in hepatocellular carcinoma was 38.09%(32/84),which was significantly lower than that in the adjacent liver tissues 100%(84/ 84),the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion:The expression of FN mRNA in hepatocellular carcinoma(HCC)is higher than that in adjacent tissues,and the expression of PTEN mRNA in hepatocellular carcinoma(HCC)is lower than in paracancerous tissues,FN and PTEN gene may be related with the occurrence and the development of hepatocellular carcinoma(HCC),which may play a role of promotion or inhibition in the occurrence,development,invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma.

［Key words］Fibronectin;Phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen;Hepatocellμlar carcinoma; Gene expression

［中图分类号］R735.7

［文献标志码］A

［文章编号］1006-2440（2016）05-0438-05

［收稿日期］2016-06-22

*［基金项目］南通市青年基金项目（WQ2014030）。

**［作者简介］许桐林，男，汉族，江苏南通人，生于1982年10月，本科，主治医师。研究方向：普通外科。E-mail：[e-mail]。