纳米颗粒增强透射免疫比浊法检测乳酸脱氢酶同工酶3方法的建立及性能评价

纳米颗粒增强透射免疫比浊法检测乳酸脱氢酶同工酶3方法的建立及性能评价

董奕裕1， 吴奕征2， 沈丽丽3， 陈 群3

（1. 浙江省荣军医院检验科，浙江 嘉兴 314000；2. 浙江大学医学院临床医学系，浙江 杭州 310029；3. 浙江省荣军医院内科，浙江 嘉兴 314000）

摘要：目的建立纳米颗粒增强透射免疫比浊法（PETIA）测定乳酸脱氢酶同工酶3（LDH3）的分析方法。方法确定最适反应条件，包括抗体浓度﹑胶乳微球粒径﹑交联剂[1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）]浓度﹑缓冲液种类及pH值﹑反应时间，并建立检测血清LDH3的PETIA方法。按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）EP5-A2文件要求，评价方法的精密度﹑线性范围﹑回收率﹑抗干扰能力和分析灵敏度，并初步建立参考区间。结果PETIA最适反应条件：抗体浓度为0.1 mg/mL﹑胶乳微球粒径为120 nm﹑交联剂（EDAC/NHS）浓度为10 mg/mL﹑缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS）﹑pH值为7.8时偶联率最佳，室温（25 ℃）和低温（4 ℃）放置24 h偶联率保持不变。采用建立的PETIA检测LDH3低值（16.5 U/L）﹑中值（65.0 U/L）和高值（155.0 U/L）的批内变异系数（CV）分别为5.77%﹑4.02%﹑3.77%，批间CV分别为6.59%﹑4.44%﹑3.93%；线性范围为3.6～200.0 U/L；平均回收率为102.1%；900 U/L类风湿因子﹑500 μmol/L胆红素﹑9 mmol/L甘油三酯﹑5 g/L血红蛋白﹑5 g/L维生素C均无明显干扰；分析灵敏度为3.6 U/L；参考区间为13.5～75.9 U/L。结论建立的PETIA测定LDH3具有方法简单﹑快速﹑灵敏等优点，且结果准确，可用于全自动生化分析仪，能够满足临床检验的要求。

关键词：乳酸脱氢酶同工酶3；纳米颗粒增强透射免疫比浊法；性能评价

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）是糖酵解中主要的酶，能够催化乳酸变成丙酮酸。1959年，Markert首次用电泳分离法发现了动物LDH具有多种分子形式，并提出了同工酶的概念。人及许多脊椎动物组织中的LDH根据电泳泳动速度的不同，可分为5种分子形式：LDH1﹑LDH2﹑LDH3﹑LDH4﹑LDH5。由于LDH在体内分布广泛，血清LDH总酶活力的组织特异性差，而LDH同工酶的分布有明显的组织特异性，所以可根据其组织特异性辅助诊断各种疾病。其中LDH3在恶性病变﹑肺部栓塞﹑肺部炎症时常增高。目前用于LDH同工酶检测的方法主要有化学抑制法﹑免疫抑制法﹑热稳定法﹑电泳法和亲和层析法。其中，化学抑制法和免疫抑制法虽能检测LDH同工酶，但抑制后检测的并非完全是单一同工酶的活力，而是残存有其他同工酶的活力；热稳定法利用来源于不同组织细胞LDH同工酶不同的化学结构引起的热稳定性差异来测定，缺点是灵敏度差；电泳法优点是准确可靠，能够了解整个LDH同工酶谱的情况，缺点是灵敏度较差，而且操作时间长；离子交换层析法的结果也十分准确，但操作时间同样很长；而颗粒增强透射免疫比浊法则可以弥补上述缺陷，实现快速检测。我们旨在建立纳米颗粒增强透射免疫比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA）检测LDH3的方法，并对其检测性能进行方法学评价。

1 材料和方法

1.1 试剂

鼠抗人LDH3单克隆抗体（美国Sigma-Aldrich公司），羧基纳米胶乳微球（浙江天科高新技术发展有限公司），标准LDH3蛋白（美国RayBiotech公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（德国Merck公司）。1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDAC]（上海源聚生物科技有限公司），N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimido，NHS）（国药集团化学试剂有限公司），2-吗啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）（国药集团化学试剂有限公司）。蛋白质浓度测定试剂盒[二辛可酸钠盐（bicinchoninic acid，BCA）法]（北京雷根生物技术有限公司）。自配干扰物质：900 U/L 类风湿因子（rheumatoid factor，RF）﹑500 μmol/L胆红素﹑5 g/L 血红蛋白（hemoglobin，Hb）﹑5 g/L维生素C和9 mmol/L甘油三酯（triglyceride，TG）。

1.2 方法原理

免疫透射比浊法是利用抗原抗体反应直接测定被测物含量的方法。样本中的LDH3与试剂中经纳米胶乳微球修饰后的LDH3抗体反应后形成抗原-抗体复合物，并形成一定浊度。用全自动生化分析仪测定由该浊度产生的吸光度（A）值大小；该浊度A值的高低在一定量抗体存在时与抗原的含量成正比。通过与同样处理的校准液比较，计算样本中的LDH3含量。

1.3 最适反应条件确定

通过确定交联剂（EDAC/NHS）浓度﹑缓冲液种类﹑pH值﹑反应时间来改变偶联效果。采用BCA法检测偶联前﹑后的蛋白量。计算公式：偶联率（μg/mg）=（原始加入蛋白质量-上清残留蛋白质量）/胶乳微球质量。原始加入蛋白质量减去上清残留蛋白质量的差值即为偶联上的蛋白质量，重复3次，取平均值计算相对偶联率。

1.3.1 抗体筛选浓度 用1% BSA倍比稀释标准LDH3蛋白作为标准品，标准品浓度为40﹑80﹑120﹑160﹑200 U/L，以浓度常数为横坐标，主波长下A值为纵坐标，多点非线性拟合绘制标准曲线，以生理盐水作为空白对照。以反应曲线，即偶联效率线性増幅来确定抗体的最适浓度。

1.3.2 不同粒径胶乳微球筛选 用1%BSA倍比稀释标准LDH3蛋白作为标准品，标准品浓度为40﹑80﹑120﹑160﹑200 U/L，以浓度常数为横坐标，主波长下A值为纵坐标，多点非线性拟合绘制标准曲线，以生理盐水作为空白对照；交联纳米胶乳微球（粒径分别为95﹑120﹑203 nm）。以浓度常数为纵坐标，主波长下A值为横坐标，多点非线性拟合绘制标准曲线，以生理盐水作为空白对照。选取反应能力最高的胶乳微球粒径为最适抗体胶乳组合。

1.3.3 EDAC/NHS浓度对抗体偶联的影响取0.1 mL羧基化纳米胶乳微球重悬于0.9 mL MES（0.1 mol/L）溶液中，分别加入不同浓度（2.5～25.0 mg/mL）的EDAC/NHS（1∶1），20 min后与1 mg抗体偶联，检测偶联效率的变化，取平缓曲线时的最低EDAC/NHS浓度。

1.3.4 缓冲液对偶联的影响 选择常用的Tris-HCL缓冲液﹑硼酸-硼砂缓冲液﹑磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液﹑磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），以得出最大偶联率的缓冲液为首选。

1.3.5 反应pH值﹑时间的选择 采用PBS调节pH值，观察不同pH值（3.5～8.0）下偶联率的变化，选择偶联率最高的pH值。室温放置2 h，让偶联达到平衡，然后在室温（25 ℃）和低温（4 ℃）下分别放置24 h，每隔1 h观察一次偶联率的变化。

1.4 LDH3免疫纳米胶乳的制备

LDH3免疫纳米胶乳的制备采用EDAC共价偶联法[1]。参照文献[1]，在0.9 mL MES溶液（0.1 mol/L）中加入0.1 mL羧基化胶乳微球（粒径120 nm）混匀，再加入10 mg EDAC/NHS（1∶1），活化20 min，12 000×g离心15 min，去上清，用1 mL PBS重悬，重复2次。然后将1 mg LDH3抗体加入到微球悬液中，室温条件下温和搅拌3 h，12 000×g离心10 min，除去未结合的抗体；沉淀用PBST缓冲液（在100.0 mL PBS中加入0.2 mL Tween-20）重悬，重复操作2次。最终保存在含5 g/L BSA的甘氨酸缓冲液中。此溶液即为致敏胶乳，超声处理后保存于4 ℃冰箱。

1.5 检测LDH3的PETIA的建立

1.5.1 试剂组分 试剂Ⅰ（R1）：1 mol/L PBS（pH值7.8）﹑4.5 g/L氯化钠﹑3.0 g/L聚乙二醇6000﹑0.1% Tween-20﹑1.0 g/L叠氮钠；试剂Ⅱ（R2）：1 mol/L PBS（pH值7.8）﹑1.25 g/L胶乳修饰LDH3抗体（胶乳直径为120 nm）﹑1.0 g/L BSA﹑1.0 g/L叠氮钠。

1.5.2 测定仪器 采用OIYMPUS AU2700全自动生化分析仪（日本奥林巴斯公司）测定。

1.5.3 分析参数 样本用量为5 μL，R1用量为150 μL，R2用量为50 μL，主波长为575 nm，副波长为700 nm，反应类型为固定时间法（Fixed），反应温度为37 ℃，反应方向为上升。第13点读取A1值，第19点读取A2值。校准类型为6AB，数据处理程序为POLYGONAL拟合曲线。

1.6 方法学评价

1.6.1 精密度 根据美国临床实验室标准化委员会（the National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）EP5-A2文件对精密度评价的要求[2]，将标准LDH3蛋白稀释成3个水平，分别为低值（16.5 U/L）﹑中值（65.0 U/L）和高值（155.0 U/L），分别测定LDH3水平。2 h内各水平连续测定20次，计算均值（x）﹑标准差（s）﹑批内变异系数（coef fi cient of variation，CV）；每天测定1次，连续测定20 d，计算 x ﹑s﹑批间CV。

1.6.2 线性分析 用1%BSA倍比稀释LDH3标准品，浓度分别为0﹑40﹑80﹑120﹑160﹑200 U/L，以浓度常数为横坐标，主波长下A值为纵坐标，列出直线回归方程和相关系数（r）。

1.6.3 回收试验 在已测得LDH3水平的血清样本中分别加入不同量的LDH3标准液进行回收试验，每个样本检测3次，计算x ，理论值为百分之百回收的推断值。

1.6.4 干扰试验 用稀释好的不同浓度的RF﹑胆红素﹑Hb﹑维生素C和TG分别与含LDH3浓度较高的血清和生理盐水做回收试验，以回收率判断是否存在干扰。

1.6.5 分析灵敏度 空白样本测定10次的x 加上2倍s，将其作为Y值代入标准曲线方程，得出的X值即为分析灵敏度。

1.6.6 参考区间 选取2014年6月—2015年9月浙江省荣军医院健康体检者120名，其中男62名﹑女58名，年龄18～69岁。空腹静脉采血，用本法测定血清LDH3浓度，并计算正常人群LDH3参考区间。

2 结果

2.1 最适反应条件确定

2.1.1 抗体筛选浓度 以LDH3标准品浓度为横坐标，主波长下A值为纵坐标，多点非线性拟合绘制标准曲线，以生理盐水作为空白对照。当抗体终浓度为0.1 mg/mL时反应能力最高。

2.1.2 胶乳微球粒径筛选 以LDH3标准品浓度为横坐标，主波长下A值为纵坐标，多点非线性拟合绘制标准曲线，以生理盐水作为空白对照。当胶乳微球粒径为120 nm时反应能力最高。

2.1.3 EDAC/NHS浓度 将活化的胶乳微球与1 mg抗体偶联，偶联效率在EDCA/NHS浓度为10 mg/mL时达到平稳期。

2.1.4 缓冲液的选择 4种缓冲液中PBS对胶乳微球-抗体的偶联率最高。

2.1.5 反应pH值和时间的选择 通过PBS调节pH值。当pH值在7.6～7.8时偶联率最高。室温（25 ℃）和低温（4 ℃）放置24 h，偶联率几乎不变。

2.2 方法学评价

2.2.1 精密度评估 LDH3低值（16.5 U/L）﹑中值（65.0 U/L）和高值（155.0 U/L）3个水平的批内CV分别为5.77%﹑4.02%﹑3.77%，批间CV分别为6.59%﹑4.44%﹑3.93%。见表1。

表1 批内与批间精密度结果

LDH3 批内批间x （U/L） s（U/L） CV（%） x （U/L） s（U/L） CV（%）低值 15.6 0.9 5.77 16.7 1.1 6.59中值 62.2 2.5 4.02 63.1 2.8 4.44高值 153.7 5.8 3.77 155.3 6.1 3.93

2.2.2 线性分析 直线回归方程为Y=-5×10-9X3-9×10-7X2+0.001 6X，r=0.998 1。线性范围可达200 U/L。见图1。

图1 PETIA测定LDH3的标准曲线

2.2.3 回收试验 在已知LDH3水平的血清中分别加入不同量的LDH3标准液，每个样本检测3次，计算x 。理论值为百分之百回收的推断值。回收率（%）=（测定值/理论值）×100%。平均回收率为102.1%。见表2。

表2 回收试验

样本号 测定值（U/L） 理论值（U/L） 回收率（%）1 17.6 16.5 106.7 2 40.4 38.5 104.9 3 75.4 77.5 97.3 4 115.2 120.5 95.6 5 162.3 155.5 104.4 6 218.9 210.7 103.9

2.2.4 干扰试验 900 U/L RF﹑500 μmol/L胆红素﹑9 mmol/L TG﹑5 g/L Hb﹑5 g/L维生素C对PETIA测定LDH3无干扰。

2.2.5 分析灵敏度 空白样本测定10次的x 加上2倍s所得值为0.005 7，将其作为Y值代入标准曲线方程，得X值为3.6，所以本法的分析灵敏度为3.6 U/L。

2.2.6 参考区间 用本法测定120名健康体检者血清LDH3水平，结果为（44.7±15.6）U/L，呈正态分布，取95%可信限（±2s）得出参考区间为13.5～75.9 U/L。

3 讨论

LDH同工酶的相对分子质量均为140 000左右，都是由4个亚单位组成的四聚体，富含于心脏中的亚基称为H，富含于骨骼肌中的亚基称为M，根据组成亚基的不同分为LDH1（H4）﹑LDH2（H3M）﹑LDH3（H2M2）﹑LDH4（HM3）﹑LDH5（M4）。控制H亚基合成的是A基因，控制M亚基合成的是B基因，以基因型来表示时，则同工酶分别相当于A4﹑A3B﹑A2B2﹑AB3和B4。人体不同部位和细胞中A﹑B 2种亚单位的含量不同，人骨骼肌和肝细胞的A∶B为10∶1，而人心肌为1∶20，肾为1∶10。A亚单位和B亚单位的生物合成分别受染色体上LDH A和LDH B基因单位点的控制。LDH几乎存在于机体各种组织细胞的细胞质中，对诊断疾病无特异性，其同工酶主要存在于脑﹑肾﹑肝﹑肺﹑淋巴结﹑心肌﹑骨骼肌﹑红细胞﹑白细胞和血小板中，且在各组织中同工酶构成差异较大，故检测LDH同工酶较单一检测LDH更具诊断价值[3]。肺部含LDH3较多，肺栓塞患者血浆LDH3明显升高。有研究证实 D-二聚体在肺栓塞后升高发生早﹑幅度大，在高水平上持续的时间短，因此D-二聚体可作为肺栓塞急性期的诊断指标；而LDH3的变化发生相对较晚，在较高水平上持续的时间较长，对D-二聚体下降后的肺栓塞亚急性期有辅助诊断价值[4]。NILLAWAR等[5]的研究结果显示，在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者中，LDH3升高较C反应蛋白更具特异性，而且LDH3能反映COPD患者治疗的疗效。肺部疾病时血清LDH3常可升高，LDH3活性增加反映了急性肺损伤导致的细胞损伤和细胞死亡。因此，LDH3是肺损伤的指标之一[6]。由于每个组织或器官的同工酶谱不同，当某组织或器官损伤或坏死时，其所含同工酶就会释入血流而引起血清同工酶谱改变。含LDH3为主的组织以肺﹑脾为代表， 脑﹑肠﹑淋巴液与内分泌腺等的含量次之。LDH及其同工酶的变化虽不能反映肺部炎症的变化，却可提示病情的变化，并可用以判断抗炎治疗的疗效。有研究显示在肝癌﹑肺癌﹑乳腺癌﹑淋巴瘤﹑鼻咽癌﹑子宫癌﹑肠癌LDH同工酶分析中LDH3均增高，说明其特异性与敏感性还不高，这种增高也是肿块快速增长以适应缺氧的一种调节[7]。但也有研究认为对肿瘤患者LDH同工酶进行分析，有助于鉴别肿瘤患者血清LDH的组织来源，对鉴别诊断﹑分清病情的主次以及采取合理的治疗有帮助。LDH同工酶还可以协助诊断疾病进展，如心肌梗死﹑肝病和先兆子痫等[8]。

以往检测LDH同工酶主要用电泳法，虽能了解整个LDH同工酶谱的情况，但其灵敏度较差，且操作时间长，结果以占总LDH活性的百分比表示，不直观。由于电泳法操作比较繁琐且不够灵敏，因此限制了LDH同工酶分析在临床上的广泛应用和推广。本研究建立的检测LDH3的PETIA精密度较高（批内CV＜6%，批间CV＜7%），正确性符合临床要求（平均回收率为102.1%，临床要求的回收率为100%±5%），具有良好的抗干扰能力（RF﹑脂血﹑溶血﹑黄疸﹑维生素C对测定结果影响较小），操作简便，线性关系好，测定范围宽，结果稳定，需要的样本量小。本研究建立的方法既克服了化学抑制法及免疫抑制法检测的并非完全是单一同工酶活力﹑热稳定法灵敏度差等缺点，又弥补了离子交换层析法操作时间长的缺陷，且样本周转时间短，能进行大批量测定，适用于全自动生化分析仪，便于中小型医院和基础实验室常规开展LDH3的检测。

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Establishment and performance of nano particle-enhanced turbidimetric immunoassay for determining serum lactate dehydrogenase isoenzyme 3

DONG Yiyu1，WU Yizheng2，SHEN Lili3，CHEN Qun3.
（1. Department of Clinical Laboratory，Rongjun Hospital of Zhejiang，Jiaxing 314000，Zhejiang，China；2. Department of Clinical Medicine，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310029，Zhejiang，China；3. Department of Internal Medicine，Rongjun Hospital of Zhejiang，Jiaxing 314000，Zhejiang，China）

Abstract：ObjectiveTo establish nano particle-enhanced turbidimetric immunoassay（PETIA） for determining serum lactate dehydrogenase isoenzyme 3（LDH3）.MethodsThe optimal reaction conditions [antibody concentration，latex particle size，1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide（EDAC）/ N-hydroxysuccinimido（NHS） concentration，the kind and pH value of buffer solution and reaction time] were determined. PETIA for determining serum LDH3 was established. According to the National Committee for Clinical Laboratory Standards EP5-A2，the precision，linear range，recovery rate，anti-interference ability and analytic sensitivity were evaluated，and the initial reference interval was established.ResultsThe optimal reaction conditions were antibody concentration 0.1 mg/mL，latex particle size 120 nm，EDAC/ NHS concentration 10 mg/mL，phosphate buffered saline（PBS） with pH value 7.8 and coupling rate remaining unchanged under room temperature（25 ℃）and low temperature（4 ℃） for 24 h. For LDH3 with low value（16.5 U/L），median value（65.0 U/L） and high value（155.0 U/L），the within-run coefficients of variation（CV） were 5.77%，4.02% and 3.77%，and the between-run CV were 6.59%，4.44% and 3.93%. The linear range was 3.6-200.0 U/L. The average recovery rate was 102.1%. The factors of 900 U/L rheumatoid factor，500 μmol/L bilirubin，9 mmol/L triglyceride，5 g/L hemoglobin，5 g/L vitamin C had no interference for PETIA in the determination of LDH3. The analytic sensitivity was 3.6 U/L. The reference interval was 13.5-75.9 U/L.ConclusionsPETIA for the determination of LDH3 is simple，rapid，sensitive and accurate，and it can be used in automatic biochemical analyzers，which can meet the requirements of clinical determination.

Key words：Lactate dehydrogenase isoenzyme 3；Nano particle-enhanced turbidimetric immunoassay；Performance evaluation

文章编号：1673-8640（2017）01-0138-05

中图分类号：：Q554

文献标志码：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.02.016

（收稿日期：2016-02-03）

（本文编辑：龚晓霖）

基金项目：嘉兴市科技局计划项目（2013AY21065）

作者简介：董奕裕，男，1968年生，硕士，主管技师，主要从事临床免疫检测工作。