抗HCV抗体灰区样本的处置方案和产生原因分析及临床提示陆银华1， 蒋玲丽1， 朱宇清1， 徐 翀1， 赵晓君1， 曹丹如1， 朱岭峰1， 顾志冬2 （1.上海市临床检验中心，上海 200126；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025） 摘要：目的探讨抗丙型肝炎病毒（HCV）抗体灰区样本产生的原因和处置方案及临床提示。方法采用5种国产试剂[4种试剂为间接酶联免疫吸附试验（ELISA）、1种试剂为双抗原夹心法]和1种进口试剂（化学发光法）检测血清中抗HCV抗体，结果不一致且在灰区范围内的样本再用重组免疫印迹法（RIBA）检测确认，并对RIBA测定结果为不确定的样本用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）测定HCV RNA。对12例处于窗口期的特殊样本分析HCV RNA的拷贝数和基因型。结果 除F试剂外，其他5种抗HCV抗体检测试剂的复检阴性符合率均≥90%；复检阳性符合率随着初检S/CO值的增大而增高，当S/CO值＞15.01时，6种抗HCV抗体检测试剂的复检阳性符合率均＞95%。采用6种抗HCV抗体检测试剂分别检测36例灰区样本，单种试剂检测的假阴性率为27.8%～94.4%；2种国产试剂随机组合后检测的假阴性率为8.3%～61.1%；2种国产试剂加进口试剂组合后假阴性率降至5.6%～22.2%；2种国产试剂加国产双抗原夹心法试剂组合后假阴性率降至2.2%～13.9%。6种试剂检测12例特殊样本抗HCV抗体的结果为阴性或部分处于厂家规定的灰区范围内，RIBA确认结果为阴性或不确定，而HCV RNA为弱阳性。12例特殊样本中有8例RNA基因分型为1b型，4例为无分型。结论对于抗HCV抗体检测试剂灰区结果，建议至少采用2种不同的初筛试剂组合对样本进行复检；必要时可引入双抗原夹心法或进口试剂作为复检的补充。为减少窗口期样本的漏检，建议将HCV RNA检测作为补充试验。 关键词：丙型肝炎病毒；抗体；假阴性率；窗口期 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染会导致丙型肝炎，由于临床症状不明显，易误诊或漏诊，延误治疗。因此，临床医师将HCV的实验室检测结果作为诊断丙型肝炎的主要依据，以便及时采取适当措施，阻断HCV的传播[1]。目前，市场上主要的抗HCV抗体检测试剂盒采用HCV基因重组蛋白（由大肠埃希菌表达）或合成肽[核心区（CORE）、NS3、NS4和NS5等蛋白片段]作为抗原包被固相载体，用间接法进行测定。由于不同厂商在HCV抗原的组合、来源、用量等方面的差异，导致临床上抗HCV抗体的检测结果有时会出现较大的偏差，从而出现漏检的情况。若用于献血员血液筛检，易造成输血后HCV感染[2]。美国疾病预防控制中心（the Centers for Disease Control and Prevention，CDC）建议根据抗HCV抗体筛查试验的S/CO值为1.0～3.8[酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）]或1.0～8.0[化学发光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）]的样本需采用重组免疫印迹法（recombinant immunoblot assay，RIBA）或病毒核酸扩增试验（nucleic acid amplification test，NAAT）进行确认[3]，国内也有类似建议[4]。甘新宇等[5]建议将抗HCV抗体检测吸光度（A）值处于CO值20%以内的样本作为灰区样本。我们对如何处理和分析灰区样本进行了讨论，同时探讨了灰区样本产生的原因，以有效节约成本，优化检测步骤。 1 材料和方法1.1 研究对象 收集2012年1月—2014年7月上海市二、三级医院及上海市血液中心各实验室接受抗HCV抗体检测的门诊及住院患者656例（其中包括产前检查27例，肝病、感染科门诊44例，上海市血液中心筛查样本20例），其中男320例、女336例，年龄14～112岁。所有样本初检结果的S/CO值均≥0.6。 1.2 方法 1.2.1 抗HCV抗体检测 4种间接ELISA试剂分别购自上海科华生物工程股份有限公司（ELISA，批号：201403011）、上海荣盛生物药业有限公司（ELISA，批号：2014503202）、苏州新波生物技术有限公司（时间分辨荧光法，批号：8600013651）、北京科美生物技术有限公司（化学发光法，批号：20140305）；双抗原夹心法试剂购自北京万泰生物药业股份有限公司（批号：CS201403）；进口化学发光法试剂购自美国雅培公司（批号：32168L100、46355L100）。以上6种试剂分别用A、B、C、D、E、F表示，顺序随机。采用上述6种试剂对656例样本进行初检，所有的操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，同时检测质控品（购自上海市临床检验中心，批号：1401）。 1.2.2 HCV确认试验 选择6种抗HCV抗体检测试剂中至少有1种S/CO值为0.7～4.0（ELISA）或0.7～8.0（CLIA），并且至少有1种试剂检测结果不完全一致的灰区样本36例，采用RIBA进行确认，RIBA试剂购于新加坡MP生物医学亚太私人有限公司（批号：AD4009、AD5002）。若RIBA确认结果为不确定，再采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）测定HCV RNA。所有操作步骤均严格按试剂盒说明书进行。 1.2.3 HCV RNA检测 HCV RNA用ABI 7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）检测，试剂购自凯杰生物工程（深圳）有限公司（批号：20140802、20150102），检测下限为500 IU/mL。检测HCV RNA的同时检测质控品（购自上海市临床检验中心，批号：1401、1501）。 1.2.4 HCV基因型检测 对HCV RNA高于检测下限的样本采用针对HCV 5'非编码（untranslated region，UTR）区的特异性引物进行逆转录及套式PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，阳性产物以双脱氧链末端终止DNA测序法进行测序，以在线HCV基因型分析软件（NCBI genotyping）进行分析。由生工生物（上海）有限公司合成PCR引物。外扩增上游引物序列为：5'-CCCTGTGAGGAACTWCTGTCTTCACGC-3'；5'-GCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCT-3'。内扩增上游引物序列为：5'-TCTAGCCATGGC GTTAGTAYGAGTGT-3'；5'-CACTCGCAAGCACC CTATCAGGCAGT-3'。引物浓度为10 pmol/μL。Taq酶、逆转录酶、dNTP等试剂均购自美国Promega公司。 1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。率的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果2.1 6种抗HCV抗体检测试剂的结果分析 除F试剂外，其他5种抗HCV抗体检测试剂的复检阴性符合率均≥90%，复检阳性符合率随着初检S/CO值的增大而增高，当S/CO值＞15.01时，6种抗HCV抗体检测试剂的复检阳性符合率均＞95%。见表1。 A～F 6种试剂检测36例灰区样本的假阴性率分别为94.4%（34/36）、63.9%（23/36）、38.9%（14/36）、66.7%（24/36）、27.8%（10/36）、13.9%（5/36）。见表2。 表1 6种抗HCV抗体检测试剂复检符合率 [例（%）]  初检范围（S/CO值） 例数 A试剂 B试剂 C试剂 D试剂 E试剂 F试剂0.60～0.99 50 49（98.0） 48（96.0） 46（92.0） 48（96.0） 45（90.0） 41（82.0）1.00～8.00 243 65（26.7） 75（30.9） 94（30.1） 85（35.0） 104（42.8） 177（72.8）8.01～15.00 110 97（88.2） 99（90.0） 103（93.6） 102（92.7） 102（92.7） 105（95.5）＞15.01 253 247（97.6） 248（98.0） 246（97.2） 250（98.8） 251（99.2） 247（97.6） 表2 36例灰区样本不同试剂的确认结果  样本号 A试剂 B试剂 C试剂 D试剂 E试剂 F试剂1 -（0.29） -（0.39） -（0.30） -（0.23） +（1.33） +（1.93）2 -（0.13） -（6.68） -（4.91） +（5.47） +（17.20） +（3.09）3 -（0.47） +（15.10） +（4.99） +（1.68） +（10.90） +（4.70）4 -（0.97） +（22.80） +（6.18） +（1.49） +（13.80） +（5.44）5 -（0.47） +（5.45） +（3.75） +（5.36） +（15.10） +（1.72）6 -（0.37） -（0.32） -（0.77） -（0.25） +（16.00） +（2.35）7 -（0.46） +（4.84） +（1.25） -（0.50） +（10.60） +（6.67）-（0.33） -（0.34） +（1.36） -（0.14） -（0.08） +（2.17）9 -（0.58） +（11.50） +（10.80） +（18.40） +（19.50） +（4.96）10 -（0.43） +（1.55） +（7.25） -（0.61） -（0.18） +（1.20）11 -（0.25） +（1.92） -（0.23） +（4.70） +（2.01） +（9.27）12 -（0.62） +（2.82） +（3.42） +（2.76） +（3.80） +（4.80）13 -（0.22） -（0.30） +（5.52） -（0.12） +（20.00） +（5.16）14 +（1.65） -（0.33） -（0.23） -（0.07） -（0.00） +（6.22）15 -（0.66） +（9.72） +（4.83） -（0.77） +（5.82） +（5.82）16 -（0.19） -（0.48） +（1.56） -（0.16） +（3.78） +（4.69）17 -（0.29） +（3.78） +（1.06） +（9.37） +（1.14） +（6.14）18 -（0.08） -（0.20） -（0.03） -（0.12） +（22.80） +（1.27）19 -（0.13） -（0.28） -（0.04） -（0.15） -（0.00） +（1.19）20 -（0.02） -（0.21） -（0.46） -（0.43） +（2.41） +（4.40）8 续表2  注：括号中为S/CO值 样本号 A试剂 B试剂 C试剂 D试剂 E试剂 F试剂21 -（0.06） -（0.23） -（0.12） -（0.30） +（3.12） +（4.72）22 -（0.06） -（0.21） +（5.22） -（0.22） -（0.27） +（1.55）23 -（0.15） -（0.23） -（0.58） -（0.22） +（1.06） +（2.78）24 -（0.12） -（0.98） -（0.03） -（0.36） +（4.43） -（0.56）25 -（0.46） -（0.20） +（3.69） -（0.15） -（0.65） +（6.51）26 +（2.64） -（0.11） +（1.97） -（0.11） -（0.28） +（3.37）27 -（0.10） -（0.10） +（1.61） -（0.20） +（1.99） +（1.96）28 -（0.24） -（0.21） -（0.18） -（0.80） +（1.91） +（5.22）29 -（0.12） +（2.57） -（0.29） -（0.27） -（0.81） +（1.06）30 -（0.19） -（0.21） +（11.12） -（0.11） -（0.09） -（0.89）31 -（0.10） -（0.19） +（5.05） -（0.19） -（0.30） +（2.62）32 -（0.51） -（0.34） +（3.87） -（0.13） +（15.18） -（0.85）33 -（0.73） -（0.21） -（0.72） +（1.43） +（2.53） -（0.37）34 -（0.36） +（1.04） +（1.32） +（2.13） +（19.60） +（2.00）35 -（0.88） -（0.11） +（5.16） +（2.51） +（3.64） -（0.44）36 -（0.15） -（0.34） -（0.13） +（1.51） +（11.40） +（3.94）假阴性率（%） 94.4 66.7 41.7 66.7 27.8 13.9 2.2 不同试剂组合后假阴性率的比较 6种试剂两两组合后测定的假阴性率为8.3%～61.1%，虽然下降明显，却仍不理想，尤其是国产试剂的两两组合（假阴性率为30.6%～58.3%）。3种国产试剂组合后的假阴性率为27.8%～50.6%，虽低于国产试剂两两组合，但还是偏高。当A～D中任意2种国产试剂加上试剂E（双抗原夹心法）或进口试剂F时，假阴性率有了明显的改善，下降至16.7%（A+B+E）、13.9%（A+B+F）、5.6%（A+C+E）、5.6%（A+C+F）、22.2%（A+D+E）、2.8%（A+D+F）、5.6%（B+C+E）、5.6%（B+C+F）、22.2%（B+D+E）、8.3%（B+D+F）、8.3%（C+D+E）、2.8%（C+D+F）；与2种试剂组合的假阴性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表3。 表3 不同试剂组合后36例灰区样本测定的假阴性率  注：与A～D中任意2种试剂组合比较，*P＜0.01 试剂组合 假阴性例数 假阴性率（%） 试剂组合 假阴性例数 假阴性率（%）A+B 21 58.3 B+C+D 10 27.8 A+B+C 11 30.6 B+C+E 2 5.6*A+B+D 18 50.0 B+C+F 2 5.6*A+B+E 6 16.7* B+D 20 55.6 A+B+F 5 13.9* B+D+E 8 22.2*A+C 13 36.1 B+D+F 3 8.3*A+C+D 10 27.8 B+E 8 22.2 A+C+E 2 5.6* B+E+F 1 2.8 A+C+F 2 5.6* B+F 5 13.9 A+D 22 61.1 C+D 11 30.6 A+D+E 8 22.2* C+D+E 3 8.3*A+D+F 3 8.3* C+D+F 1 2.8*A+E 8 22.2 D+E 10 27.8 A+E+F 1 2.8 D+E+F 1 2.8 A+F 5 13.9 D+F 3 8.3 B+C 12 33.3 E+F 1 2.8  图1 36例灰区样本RIBA 4个抗原区的分布情况 2.3 36例灰区样本RIBA 4个抗原区的分布情况 RIBA阳性条带频度分布最高为核心区（CORE），其次为NS3区（NS3-1和NS3-2），最低为NS5区。见图1。 2.4 窗口期样本的分析 在656例样本中发现有12例处于窗口期的样本，6种抗HCV抗体检测试剂测定结果为阴性或处于灰区范围内，RIBA确认结果为阴性或不确定，HCV RNA检测结果为阳性，其中有8例样本HCV RNA基因分型为1b型、4例为无分型。见表4。 表4 12例窗口期样本6种抗HCV抗体检测试剂、RIBA、HCV RNA及基因分型结果  注：S/CO值＜1为阴性；标“*”的数字为处于灰区范围 样本号 S/CO值 RIBAHCV RNA（IU/mL） 基因型A试剂 B试剂 C试剂 D试剂 E试剂 F试剂JY0109 0.070 0.17 0.09 0.03 0.02 1.63 不确定 3.59×102 无分型JY0128 0.017 0.19 0.00 0.03 0.05 3.16 阴性 9.25×102 无分型JY0136 0.147 0.34 0.00 0.08 0.03 1.02 阴性 3.45×103 无分型JY0156 0.077 0.27 0.76* 0.15 0.83 1.71 阴性 6.76×102 无分型JY0211 0.053 0.15 0.00 0.03 0.14 2.11 阴性 7.39×102 1b 10023 0.247 0.32 0.10 0.11 0.15 2.65 不确定 6.51×106 1b 10044 0.417 0.90* 0.92* 1.23* 1.38 4.52 阴性 1.82×105 1b X5 0.137 0.30 0.18 0.79* 0.03 2.46 阴性 1.77×103 1b X29 0.320 0.30 1.80* 0.07 0.00 1.47 阴性 8.20×102 1b X32 0.487 1.52* 0.69 2.07* 0.08 1.43 不确定 5.09×103 1b X40 0.440 0.34 0.86* 0.15 0.02 1.82 阴性 2.33×103 1b X51 0.320 0.39 0.20 0.97* 4.44 1.65 阴性 1.53×103 1b 3 讨论目前，在临床上应用的肝炎血清学指标中抗HCV抗体存在的问题最多[2]。在实际工作中，经常会遇到处于灰区范围内的样本各种试剂检测结果不一致的情况。除了采用RIBA或HCV RNA确认外，有无更经济、有效的方法可以解决这样的问题？有文献报道，先用敏感性高的试剂做初筛，保证用血的安全性，再用特异性强的试剂做复检，避免浪费宝贵的血液资源[6]。本研究结果显示，不同试剂测定抗HCV抗体弱阳性样本的差异很大，假阴性率为13.9%～94.4%。产生这种差异的原因可能有：（1）分析前样本处理不当（如样本凝集不充分、离心不完全、贮存条件不符合、样本反复冻融等）[7-8]；（2）如测定方法为手工操作，可能会存在操作上的误差，如孵育时间不足、洗板次数过多等均会造成假阴性的结果；（3）不同的ELISA试剂生产厂商所使用的HCV抗原的来源、质量、包被技术和包被浓度以及各成份比例也有差异，导致测定同一份样本的抗HCV抗体时结果可能会出现较大的差异，尤其是对弱阳性样本或仅出现HCV单个蛋白成份抗体的样本差异更大[9]。 本研究使用的A试剂包被HCV病毒抗原为基因工程蛋白，由大肠埃希菌表达，包括核心区（CORE）和NS3蛋白片段；B试剂包被的抗原和标记抗原均为基因工程抗原，包括核心区（CORE）、NS3和NS4蛋白片段；C试剂包被的抗原为合成多肽抗原和基因工程抗原，包括核心区（CORE）、NS3、NS4和NS5蛋白片段；D试剂包被的抗原为基因重组蛋白，由大肠埃希菌表达，包括核心区（CORE）、NS3、NS4和NS5蛋白片段。A～D 4种试剂测定36例灰区样本的假阴性率分别为94.4%、66.7%、41.7%、66.7%；当任意2种试剂组合后，假阴性率明显下降。以上4种试剂作为初筛试剂，强调的是高敏感性，所以其特异性就较差。如果使用高特异性的试剂，如双抗原夹心法抗HCV抗体试剂进行复检，将大大减少假阴性或假阳性的发生。本研究结果显示，使用双抗原夹心法试剂与初筛试剂组合后，假阴性率进一步降低，最低仅为5.6%。美国雅培公司的化学发光法抗HCV抗体检测试剂中含有HCr43蛋白和c100-3抗原。HCr43来自于NS3和CORE 2个编码区序列；c100-3抗原包含了NS3和NS4非结构区域[10]。因其敏感性高，同样可作为初筛检测的补充。将36份灰区样本进一步作抗原条带分析，结果显示RIBA阳性条带频度分布最高为核心区（CORE），其次为NS3（NS3-1和NS3-2），提示4家国产初筛试剂可适当加强核心区（CORE）和NS3区的抗原比例，提高检出率。 另外，本研究还发现有12例样本A～D 4种试剂抗HCV抗体检测结果为阴性或处于厂商规定的灰区范围，RIBA确认结果为阴性或不确定，而HCV RNA 病毒载量为弱阳性。这部分样本可能处于窗口期或者血清转换期，说明HCV RNA检测与血清学检测并不完全平行，可作为互补检测来解决窗口期问题[11]。基因分型结果显示，12例样本中有8例为1b型、4例为无分型，提示早期感染的HCV基因型可能以1b型为主。对于处于窗口期的样本，除定期复查（1个月以后）[12]外，还可在进行血清抗HCV抗体检测的同时增加HCV RNA检测作为补充试验，以减少漏检。 综上所述，各种试剂盒在设计、生产工艺上的差异，如抗原包被基因片段不同、抗原不纯等会导致其敏感性和特异性出现差异，而且患者血清处于窗口期等因素也可引起假阴性或假阳性结果。因此，在临床检测工作中，建议对于灰区样本应使用至少2种试剂复检，有条件的临床实验室还可以双抗原夹心法或进口试剂作为复检的补充，以确保检测结果的可靠性。建议将HCV RNA检测作为补充试验，以减少窗口期样本的漏检。 参考文献： [1]杨芳，邢文革. 丙型肝炎病毒的检测策略及其应用[J]. 中华肝脏病杂志，2008，16（12）：952-954. [2]胡翠华，李金明，王露楠，等. 用不同的ELISA试剂盒检测抗-HCV弱阳性血清标本的结果分析[J].实用肝脏病杂志，2004，7（3）：148-150. [3]ALTER M J，KUHNERT W L，FINELLI L，et al. Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention[J]. MMWR Recomm Rep，2003，52（RR-3）：1-13. [4]谷金莲，祁自柏，王尊文，等. 发光试剂与酶联免疫试剂检测丙型肝炎抗体的临床评价[J]. 中国生物制品学杂志，2005，18（5）：407-408. [5]甘新宇，杨洋，于丽君，等. ELISA检测抗-HCV抗体灰区设置的探讨[J]. 国际检验医学杂志，2012，33（11）：1405-1406. [6]安社刚，卢新明，杨来智. 多厂家抗-HCV ELISA检测结果分析[J]. 标记免疫分析与临床，2011，18（3）：179-181. [7]陈显，朱绍汶，黄成垠，等. ELISA法检测抗-HCV灰区设置探讨[J]. 临床输血与检验，2013，15（3）：243-244. [8]王春年. ELISA检测方法灰区结果原因浅析[J]. 工企医刊，2009，22（6）：41-42. [9]王晓艳，伊瑶，陈斯勇，等. 丙型肝炎病毒的病毒学检测方法[J].中华实验和临床病毒学杂志，2001，25（2）：158-161. [10]高丽，杨绍敏. HCV基因分型进展及临床意义[J].传染病信息，2013，26（2）：122-125. [11]杨振，祁自柏，于洋，等. 丙型肝炎病毒窗口期感染核酸阳性血清检测和基因型别分型[J]. 中国预防医学杂志，2008，9（7）：602-605. [12]窦亚玲，荣嵘，国秀芝，等. 免疫印迹法对HCV抗体弱阳性标本的确认价值[J]. 中华检验医学杂志，2009，32（9）：984-988. Causes and disposal scheme for grey zone samples of anti-HCV antibody determination LU Yinhua1，JIANG Lingli1，ZHU Yuqing1，XU Chong1，ZHAO Xiaojun1，CAO Danru1，ZHU Lingfeng1，GU Zhidong2. Abstract：ObjectiveTo investigate the causes and disposal scheme for grey zone samples of anti-hepatitis C virus（HCV） antibody determination.MethodsAnti-HCV antibody were determined by 5 domestic kits [4 kits using indirect enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and 1 kit using double antigen sandwich method] and 1 imported kit using chemiluminescence immunoassay. Samples with inconsistent results were further determined by recombinant immunoblot assay（RIBA）. Then，real-time fuorescence quantitation polymerase chain reaction（PCR） was used to determine indeterminate samples for HCV RNA in RIBA. A total of 12 samples in window period were determined by HCV RNA for copies and genotypes.ResultsExcept kit F，the other 5 kits showed review negative coincidence rates ≥ 90%. Review positive coincidence rates were increased with the increasing of initial S/CO ratio. When S/CO ratio was ＞15.01，6 kits showed review positive coincidence rates ＞ 95%. The false negative rates of single 1 kit were 27.8%-94.4%. The false negative rates of 2 domestic kits randomly were 8.3%-61.1%，the false negative rates of 2 domestic kits randomly with 1 imported kit were 5.6% -22.2%，and the false negative rates of 2 domestic kits randomly using indirect ELISA with 1 domestic kit using double antigen sandwichmethod were 2.2%-13.9%. The results of 12 samples in window period by 6 kits were negative or positive partly in grey zone，the results by RIBA were negative or indeterminate，and the results for HCV RNA was weakly positive. The 8 of 12 samples in window period were genotype 1b，and the other 4 samples had no genotype.ConclusionsWhen the results are in grey zone，it should use at least 2 different kits for reviewing. Kit using double antigen sandwich method or imported kit can be introduced for supplement. In order to reduce the missing determination of samples in window period，it suggests that HCV RNA determination can be used as supplement. Key words：Hepatitis C virus；Antibody；False negative rate；Window period （收稿日期：2016-02-24） （本文编辑：龚晓霖） 文章编号：1673-8640（2017）01-0008-06 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.01.003 基金项目：上海市卫生和计划生育委员会资助项目（20124185）；上海市卫生和计划生育委员会青年科研计划项目（20114Y181） 作者简介：陆银华，女，1980年生，学士，主管技师，主要从事免疫检测和质量管理工作。 通信作者：顾志冬，联系电话：021-64370045。 |
|
|
