血浆（1，3）-β -D-葡聚糖检测对血液病患者侵袭性真菌病的诊断价值萧晨路，韩立中，倪语星 摘要：目的 评价（1，3）-β-D-葡聚糖（BDG）检测（简称G试验）对恶性血液病患者侵袭性真菌病（IFD）的诊断价值。 方法 回顾性分析399例血液系统肿瘤患者每周2～3次的血浆G试验数据，以《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则（修订版）》中的标准作为判断标准，利用SPSS 11.5统计软件分析G试验对IFD的诊断价值。 结果 G试验诊断IFD的敏感性为78.5%，特异性为79.8%，阳性预测值为75.0%，阴性预测值为82.7%。结论 血浆BDG水平与IFD感染有直接联系，每周检测2～3次，结合影像学判断方法能帮助诊断和排除IFD，提高IFD临床诊治效果。 关键词：（1，3）- β-D-葡聚糖；侵袭性真菌病；血液系统肿瘤 近年来由于造血干细胞移植、实体器官移植的广泛开展，高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物的应用以及各种导管的体内介入、留置等，临床上侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）的患病率明显上升［1-2］，成为骨髓及器官移植受者、接受化疗的恶性血液病和恶性肿瘤患者、获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者以及其他危重病患者的严重并发症及重要死亡原因［2］。目前，血浆真菌细胞壁成分——（1，3）-β-D-葡聚糖［（1，3）-beta-D-glucosan，BDG］检测（简称G试验）、曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测（简称GM试验）及血液和支气管肺泡灌洗液中的各种真菌聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是诊断IFD的微生物学检测方法，其敏感性和特异性均达到80%以上［3-5］。本研究对G试验诊断IFD的临床可靠性和预测IFD的疗效进行动态监测，旨在探讨BDG在血液病患者IFD中的临床价值。 材料和方法一、研究对象 收集2013年1至12月上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科（包括骨髓移植病区和血液临床中心）患者399例，其中男230例、女169例，中位年龄（年龄范围）为41.19（17～77）岁。其中急性非淋巴细胞白血病203例、急性淋巴细胞白血病86例、骨髓增生异常综合征16例、非霍奇金淋巴瘤43例、霍奇金淋巴瘤21例、多发性骨髓瘤15例、再生障碍性贫血13例、其他病例2例。 二、仪器与试剂 MB-80微生物动态快速检测系统、T01智能恒温仪、冰浴槽以及GKT25M Set动态真菌检测试剂盒均由北京金山川科技发展公司生产。 三、方法 1. 分组 IFD诊断依据《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则（修订版）》［6］中的标准并做适当调整。具体诊断标准为：（1）IFD确诊病例：绝大多数情况需在病变组织中检出真菌成分；（2）IFD临床诊断病例：至少符合1项宿主因素，1项微生物学标准或可能感染部位符合1项临床标准；（3）IFD疑似病例：至少符合诊疗原则所列的1项宿主因素，可能感染部位符合1项临床标准，但无微生物学证据。按上述标准，本研究中的研究对象被分为确诊IFD组（2例）、临床诊断IFD组（128例）、可疑IFD组（101例）和非IFD组（168例）。 2. 抗真菌治疗 对于出现粒细胞缺乏伴发热的患者进行病原菌（细菌和真菌）培养（痰、血等），并给予一线广谱抗菌药物——碳青霉烯类药物（亚胺培南或美罗培南）及口服氟康唑进行治疗，并依据细菌学和药物敏感性试验结果作相应调整。广谱抗菌药物治疗5 d无效者行胸部计算机断层扫描（computerized tomography，CT），CT显示肺部浸润性病灶和/或G试验呈现阳性的患者停用氟康唑，改用广谱抗真菌药物如伊曲康唑或伏立康唑、醋酸卡泊芬净治疗可能的曲霉感染。 3. 影像学检查 在记录G试验结果的同时对部分患者进行影像学检查（CT或高分辨率CT），并记录结果。 4. 血浆BDG的检测 所有操作步骤均按照试剂盒说明书进行，用无热原抗凝采血管采取静脉血2 mL，以1 000×g离心1 min分离血浆。取上清0.1 mL，加至0.9 mL的样本处理液D中，混匀后置70 ℃恒温10 min，取出后立刻放入冰水浴中，为待测血浆样本。待测样本0.2 mL直接加至酶反应主剂A中，溶解后移液至标准玻璃反应管，插入MB-80微生物动态快速检测系统中进行反应，反应结束后仪器自动计算待测血浆中BDG的含量。 四、统计学方法 按照厂家推荐的60 pg/mL为诊断界值，将BDG＞60 pg/mL定为阳性，应用SPSS 11.5软件进行统计分析，计算G试验的阳性率、阴性率、敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。临床诊断IFD组中死亡与好转患者的数据采用2个独立样本t检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结 果一、G试验对血液病患者IFD的诊断价值 临床诊断IFD组G试验阳性率为78.1%，可疑IFD组G试验阳性率为18.8%，非IFD组有134例患者G试验阴性，阴性率为79.8%。将确诊IFD以及临床诊断IFD作为真阳性，非IFD作为真阴性，计算出G试验的敏感性为78.5%，特异性为79.8%，阳性预测值为75.0%，阴性预测值为82.7%。见表1。 表1 血浆G试验对血液病患者IFD的诊断价值［例（%）］  组别例数 BDG阳性 阴性确诊IFD组 2 2（100.0） 0（0.0）临床诊断IFD组 128 100（78.1） 28（21.9）可疑IFD组 101 19（18.8） 82（81.2）非IFD组 168 34（20.2） 134（79.8）合计 399 155（38.9） 244（61.2） 二、BDG在患者病程中的动态变化 本研究128例临床诊断IFD患者中死于肺部IFD感染者22例，好转者106例。其中有49例接受了抗真菌治疗。以临床诊断IFD病例开始使用抗真菌药物为诊断时间点，首次G试验阳性结果出现在临床诊断前15 d至临床诊断后3 d，平均出现于临床诊断前3.5 d。在49例接受了抗真菌治疗的临床诊断IFD患者中，77.6%（38/49）的患者出现了肺部IFD的特征性影像学改变，仅有3例为典型的月晕征，21例为实变影，5例为新月征，4例为毛玻璃样改变， 2例为结节影，3例为混合影像学改变，11例未出现明确影像学改变。38例出现影像学改变的患者，有28例出现了BDG水平的升高。 连续监测临床诊断I F D患者血浆G试验结果，好转组、死亡组BDG水平分别为（100.63±47.51）、（364.97±96.24）pg/mL，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。  图1 死亡组与好转组患者BDG水平随治疗时间的变化 讨 论IFD是恶性血液病患者的常见并发症。由于缺乏典型的临床表现、实验室检查阳性率低、影像学表现缺乏特异性，常导致IFD诊断困难，易发生漏诊或误诊。目前，欧美国家及我国IFD的诊断标准只有2条：组织病理学证据和活组织样本或正常情况下无菌腔液和/或组织样本真菌培养阳性［7］。而血液病患者病情较为严重且常合并其他感染性疾病，累及器官组织不明确，侵入性检查较难实施，致使IFD诊断较困难。近年来，非侵袭性实验室技术尤其是真菌抗原检测受到广泛关注，主要包括GM试验和G试验，已成为真菌感染的诊断标准之一 。BDG广泛存在于除接合菌、隐球菌之外的真菌细胞壁中，占真菌细胞壁成分的50%以上，当发生IFD时，BDG可以从真菌胞壁释放，进入血液或其他体液中，而浅表真菌感染（如口咽部念珠菌病等）或真菌定植时BDG极少释放入血液。因此检测血浆BDG水平对诊断IFD具有较高的特异性［5-8］。 G试验作为诊断IFD的方法被国内外广泛应用，然而不足之处就是在检测中可能出现假阳性和假阴性。造成G试验假阳性的具体原因包括：（1）中空纤维超滤膜洗涤液、肾透析仪（人工肾、血液透析仪）洗涤液残留；（2）纱布、棉球等实验室污染；（3）抗肿瘤药物中蘑菇葡聚糖、K多聚糖等成分含有BDG类似物；（4）化疗或放疗引起的黏膜炎症，使得食物中BDG可以通过受损的胃肠道黏膜进入血液；（5）以真菌为原料制成的抗菌药物；（6）感染某些细菌［8-11］。本研究中有24例患者在动态监测时出现G试验值极端升高（＞1 000 pg/mL）的现象，调查后发现是使用了香菇多糖等药物产生交叉抗原的缘故。综上所述，当G试验结果出现异常升高时需要排除其他药物产生的假阳性。本研究收集的临床诊断IFD患者中，有28例BDG监测结果为阴性，被认为是假阴性结果，这可能与真菌种类有关，如此组中有8例患者在黏膜等部位培养出真菌。据研究报道，浅部真菌感染时，BDG未被释放出来，体液中BDG水平不增加，导致G试验呈假阴性［7］。 本研究收集的399例患者根据《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则（修订版）》进行分组。以确诊IFD以及临床诊断IFD作为真阳性，非IFD作为真阴性，计算出G试验的敏感性为78.5%，特异性为79.8%，阳性预测值为75.0%，阴性预测值为82.7%。可以看出G试验对IFD有较高的阴性预测价值，能帮助诊断和排除IFD，提高IFD的临床诊治效果。 本研究结果显示，患者血浆BDG水平与其病情进展也有一定的联系。临床诊断IFD组中好转患者连续检测血浆BDG，血浆BDG水平在治疗后1～2周内呈现下降趋势，而死亡组患者的血浆BDG水平则维持在较高水平并有明显升高趋势，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。而且部分抗真菌治疗有效的患者在3周之内血浆BDG仍然＞60 pg/mL，提示抗真菌治疗需要很长的时间，目前国内外对于抗真菌治疗的疗程还未达成共识。当患者接受抗真菌治疗后血浆BDG水平仍持续升高，则提示需要更换抗真菌药物或联合应用2种抗真菌药物。因此，对于IFD高危患者进行连续血浆BDG水平监测，将有助于患者病情监测及药物的调整，同时血浆BDG持续升高也预示患者预后较差。 肺部高分辨CT检查可以帮助诊断IFD，比较公认的特征性影像为月晕征。33%～60%的IFD患者可出现月晕征，这一特征性影像改变仅在真菌感染发生的最初5 d内出现，其中大约75%的患者月晕征会在1周内消失，因此IFD的这一影像学特性限制了高分辨CT在IFD早期诊断中的应用［12-14］。本研究临床诊断IFD患者中77.6% （38/49）出现了肺部IFD的特征性影响学改变，仅有3例为典型的月晕征，11例表现为实变影，5例为新月征，4例为毛玻璃样改变， 2例为结节影，3例为混合影像学改变，11例未出现明确影像学改变。G试验一般早于影像学3～11 d出现结果。将G试验与影像学指标共同考虑能更好地诊断IFD。为了更好地治疗IFD，应该将G试验和影像学的结果相结合指导抗真菌药物的经验性治疗和/或抢先治疗，这有利于减少广谱抗真菌药物的使用，预防耐药菌株的增加。 总之，血浆G试验对IFD有着较高的诊断价值，将G试验与高分辨率CT检查综合分析可以在疾病早期进行诊断，为临床医生尽早干预治疗节约时间，降低患者死亡率，帮助临床合理用药，防止抗真菌药物的过度使用。 参考文献 ［1］PAGANO L，CAIRA M，CANDONI A，et al. 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The detection of （1，3）-beta-D-glucosan in hematological patients with invasive fungal disease XIAO Chenlu，HAN Lizhong，NI Yuxing. Abstract：Objective To evaluate the detection of （1，3）-beta-D-glucosan（BDG）（G test） in hematological patients with invasive fungal disease （IFD）. Methods A retrospective study was performed for 399 hematological malignancy patients，plasma G tests were performed for 2-3 times a week. The Principle and Diagnostic Criteria of the Disease of Hematopoietic System/Tumor in Patients with Invasive Fungal Infection（Revised Edition） was used as criteria. The diagnostic significance was evaluated by SPSS 11.5 software. Results The sensitivity of G test was 78.5% for the diagnosis of IFD，the specificity was 79.8%，the positive predictive value was 75.0%， and the negative predictive value was 82.7%. Conclusions Plasma BDG is correlated with IFD. Plasma G test should be taken 2-3 times per week. Combined with medical imaging，G test could improve the diagnosis of IFD and treatment efficiency and reduce the medical burden of patients. Key words：（1，3）-beta-D-glucosan；Invasive fungal disease；Hematological malignancy （收稿日期：2015-08-16） （本文编辑：姜 敏） 基金项目：卫生公益性行业科研专项（201002021） 作者简介：萧晨路，女，1984年生，硕士，技师，主要从事侵袭性真菌病快速诊断的实验研究。 通讯作者：倪语星，联系电话：021-64370045-600633。 |
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