两种不同留样方法比较HC2和Cobas 4800系统高危型人乳头瘤病毒的检出一致性

两种不同留样方法比较HC2和Cobas 4800系统高危型人乳头瘤病毒的检出一致性

何金龙1， 赵瑞萍2， 陈 翠3， 夏威夷1， 覃 西1
（1.海南医学院附属医院检验科，海南 海口 570102；2.彭阳县人民医院检验科 ，宁夏 彭阳 756500；3.海南医学院热带医学与检验医学院，海南 海口 571199）

关键词：高危型人乳头瘤病毒；HC2；Cobas 4800系统

高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持续性感染是引起宫颈癌的主要生物学病因［1］。目前，世界卫生组织确认的致癌性HR-HPV主要有13种亚型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及68型），不同地区的主要感染亚型有一定差异［2-3］。研究发现，不同亚型HR-HPV的致癌力、致癌类型及预后有所不同［4］。 HR-HPV负荷量的高低，是否有多重感染，其致癌风险也不一样［5-6］。因此，进行有效的HR-HPV载量-分型联合检测对于宫颈癌的防治有重要意义，但目前能同时提供这2类结果的检测方法存在较高的假阳性率［7］。HC2和Cobas 4800检测系统均为通过美国食品与药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）认证的方法，在HRHPV检测上各具优势，且在HR-HPV的检出率方面具有相似的准确性和良好的一致性［1，8］，提示可将二者联合用于全面评价患者HPV感染情况，但2个实验在国内均属于高价项目，受限于我国居民收入水平，进行大规模临床筛查存在难度。本研究拟对2个检测项目共同的取样环节进行改良性探索，为寻找降低检测成本以减少患者支出的方法，比较了使用经HC2检测预处理过的样本进行分型与分别取样检测时，HC2和Cobas 4800系统检出率的一致性。

一、材料和方法

1.　研究对象 161份宫颈脱落上皮标本采集自2013年4至8月海南医学院附属医院进行宫颈癌防癌筛查者。其中实验组110份，以HC2专用采样管取样，先进行HC2的预处理和结果检测，再对剩余标本进行Cobas 4800分型检测。对照组51例，每例分别用HC2专用采样管及BD PrepStain 细胞学采样管采2份标本，分别进行HC2和Cobas 4800检测。

2.　仪器与试剂 DML2000 基因杂交信号扩大系统与HC2-HPV检测试剂盒均购自美国Digene公司；Cobas 4800检测系统与配套试剂盒均购自瑞士罗氏公司。

3.　检测方法 （1）HC2检测：按照试剂说明进行操作，用DML2000检测系统判读放大信号并演绎结果。结果判断：HPV-DNA≥1.0 pg/mL 或5 000拷贝/次即为阳性，可一次性检测13种HR-HPV，不做具体分型，结果以半定量形式报告。（2）Cobas 4800检测：按照仪器和试剂说明操作，对实验组和对照组进行DNA提取、聚合酶链反应（polymerase chain raction，PCR）扩增。结果判断：Cobas 4800可检测包含HC2全部型别在内的14种HR-HPV，系统将HR-HPV分为16、18及12种其他型别3类，其中1类或以上阳性即为HR-HPV阳性（HPVl6和18型的检测下限分别为300拷贝/mL与600拷贝/mL），不报告病毒载量。

4.　统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。同时采用配对χ2检验和Kappa一致性检验判断HC2与Cobas 4800检出结果的一致程度。以P＜0.05为差异有统计学意义。Kappa值大小所代表的一致性强弱根据文献［9］进行6个区段的划分：一致性极差（＜0），一致性微弱（0～0.20），一致性弱（0.21～0.40），中度一致（0.41～0.60），高度一致（0.61～0.80）及一致性极强（0.81～1.00）。

二、结果

1.　对照组HC2与Cobas 4800系统HR-HPV的检测结果比较 分别采样时，HC2与Cobas 4800检测HR-HPV的一致率为92.15%，结果差异无统计学意义（P=0.625），Kappa值为0.704。见表1。

表1　HC2与Cobas 4800分别进行采样检测HR-HPV的结果比较　［%（例数）］

注：χ2=0.25，P=0.625

Cobas 4800　HC2-HPV合计阴性　阳性阴性　80.39（41）　1.96（1）　82.35（42）阳性　5.88（3）　11.76（6）　17.65（9）合计　86.27（44）　13.73（7）　100.00（51）

2.　实验组HC2与Cobas 4800系统HR-HPV的检测结果比较 实验组Cobas 4800有2例结果无效。有效的108例结果与HC2比较，一致率为67.59%，差异具有统计学意义（P＜0.001），Kappa值为0.402，44.73%（34/76）的HC2阳性标本分型结果呈阴性。Cobas 4800检出的阳性标本中，有2例HPV16及18的分型结果无效。见表2。

表2　HC2检测后的剩余标本进行Cobas 4800系统分析与HC2结果的比较　［%（例数）］

注：χ2=29.26，P＜0.001

Cobas 4800　HC2-HPV合计阴性　阳性阴性　28.70（31）　31.48（34）　60.18（65）阳性　0.93（1）　38.89（42）　39.82（43）合计　29.63（32）　70.37（76）100.00（108）

三、讨论

宫颈癌是目前女性第二大常见恶性肿瘤，最新的世界卫生组织宫颈癌筛查及处理方案指南将HR-HPV检测作为筛查的首选［10］。HC2是目前国际公认的HPV DNA检测方法，其优势在于可一次性检测出13种HR-HPV，并可对病毒进行半定量，有较高的敏感性和特异性，重复性好，缺点在于不能进行具体分型［1，11］。基于荧光定量PCR原理的Cobas 4800检测系统能将主要的HR-HPV 16和18型与其他型别进行区分，并可判断感染者是否为合并这2型的多重感染。

关于HC2与Cobas 4800检测系统的方法学比较，国内外均有相关研究。PARK等［12］以基因测序分型结果为标准，HC2的检出特异性虽然低于Cobas 4800，但敏感性更高，二者的检出一致率达89.9% 。有学者比较了HC2与Cobas 4800对CIN2级及以上宫颈病变的临床敏感性，认为二者结果具有高度的一致性［8］。本研究结果显示：分别进行采样时，HC2与Cobas 4800对防癌筛查体检者HR-HPV的检出具有较高的一致性，与多数类似研究的结论基本一致。

本研究实验组中，除去分析失败的2份标本，以Cobas 4800系统分析经HC2试验预处理后的剩余标本所得的检测结果与HC2结果的一致率仅有67.59%。出现结果不一致的主要原因是，在此条件下分型结果的假阴性率过高。进一步对检测结果的观察发现，有2份HC2阳性标本在Cobas 4800结果中提示12种其他高危型别阳性，但16及18型分型均无效。造成结果一致性不理想的原因可能有：（1）用于Cobas 4800分析的标本量不足，部分标本因水浴加热、操作过程中发生遗漏及除去用于HC2检测所用液体量后已不足1.5mL，虽可用生理盐水进行补足，但实际HR-HPV浓度可能已低于Cobas 4800的检测下限导致假阴性或分析失败。（2）HC2预处理后的标本pH值过高，HC2的裂解液为强碱性，适合检测HC2，但对于PCR反应可能并非最佳，有学者尝试将标本HC2预处理后的pH值调至7.4后再行PCR检测，其PCR结果的假阴性率低于本研究［13］。（3）HC2标本经裂解过程后释放出的HPV-DNA单链容易降解。（4）HC2与Cobas 4800系统能分别与不同的低危型HPV发生交叉反应［14］，可能也是导致结果不一致的原因之一。

因此，这种将HC2检测预处理后的标本直接用于Cobas 4800检测的做法，虽能节约HR-HPV载量-分型联合检测的成本，但会导致分型结果不可靠，目前尚不具备临床应用价值。是否能够通过对实验组的操作步骤做进一步改良（如缩短2个检测的间隔时间、将标本超低温冷冻保存、分型检测前调整标本pH值等）来提高二者检测结果的一致性，有待于进一步研究。

参考文献

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［14］刘宏图. 全国妇产科临床诊疗新进展研讨会论文集［C］. 深圳：中华医学会继续教育部，2011.

（收稿日期：2015-09-14）

（本文编辑：范基农）

基金项目：海南省卫生厅科研立项项目（琼卫2013支助-055号）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201311810040）；海南医学院大学生创新性计划项目（HYCX201206）

作者简介：何金龙，男，1986年生，学士，技师，主要从事肿瘤免疫学的相关研究工作。

通讯作者：覃 西，联系电话：[phone]。