专题笔谈│脓毒症免疫动力学与免疫抑制

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专题笔谈│脓毒症免疫动力学与免疫抑制

李　宁1，曾其毅2

中国实用儿科杂志  2017  Vol.32（6）：408-413

摘要

脓毒症是危重病主要死亡原因之一， 脓毒症发病后的长期免疫抑制是其远期高病死率的主要原因。认识脓毒症免疫动力学及其免疫抑制， 对防止和减轻免疫抑制， 降低病死率有重要意义。脓毒症早期呈高炎症反应状态， 在炎症损伤组织细胞的同时， 也引起免疫细胞损伤致免疫抑制， 这是脓毒症免疫抑制的基础； 中期呈混合性免疫状态， 炎症和抗炎机制相互抗衡， 炎症损伤继续， 免疫功能进一步抑制； 后期若病情进一步恶化， 免疫抑制严重， 导致免疫功能低下并最终发展成免疫麻痹。依据免疫动力学和免疫抑制的应对尚未有特效疗法， 有待进一步研究。

关键词

脓毒症；免疫动力学；免疫紊乱；免疫抑制

中图分类号：Ｒ72　文献标志码：A　

作者单位： 1.东莞市儿童医院新生儿科， 广东  东莞  523325；2.南方医科大学珠江医院儿科中心，广东  广州  510280
通讯作者：曾其毅，电子信箱：[e-mail]

脓毒症（sepsis）是许多感染性和非感染性疾病如烧伤、创伤、胰腺炎等的共同病理生理过程，是儿童危重症死亡的首位原因，其病死率高，耗费资源高， 治疗困难。全球每年约有2000万人罹患脓毒症，其是儿科重症监护病房（ICU）的主要死亡病因。美国2008～2012年脓毒症发病率346/100 000～436/100 000，病死率17.5%～22.2%，平均每年用于脓毒症相关性疾病的医疗费用高达170～200亿美元［1-2］。更为严峻的问题是脓毒症发生后会使机体产生严重的免疫紊乱，导致近期和中长期的免疫抑制，对健康带来严重伤害。因此，脓毒症导致的免疫紊乱和免疫抑制越来越引起强烈关注。

脓毒症曾被认为是感染导致的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。随着对脓毒症认识的深入， 免疫动力学异常在脓毒症病理生理学中的地位愈显重要。2016年世界危重症医学协会更新了脓毒症的定义及诊断标准， 认为脓毒症的实质是机体在对抗病原或应激过程中所产生的免疫应答失控， 从而导致的多脏器功能障碍［3］。这个过程的关键问题是机体的严重免疫紊乱， 不仅表现为高炎症反应状态所导致的多系统多器官损害， 更发展为由失控的免疫激活所导致的严重免疫抑制和免疫麻痹。以前认为， 脓毒症的死亡表现为双峰， 即在数天内由于不充分的液体复苏造成心肺功能衰竭的早期死亡高峰， 和治疗数周后持续多脏器功能损害或衰竭的晚期死亡高峰。随着早期诊断、 目标靶向疗法（goal-target therapy）、 抗生素使用、 器官功能支持等综合治疗带来脓毒症30 d存活率的改善， 免疫抑制导致的脓毒症患者居高不下的远期病死率（40%～80%）则成为脓毒症的第三死亡高峰［4-5］。这意味着， 如果脓毒症免疫抑制的问题不能解决，对脓毒症的治疗就未取得根本性突破。本文将就脓毒症不同阶段的免疫动力学、 免疫抑制的发病机制、 免疫抑制的应对策略等方面进行阐述。

1  脓毒症不同阶段的免疫动力学与发病机制

脓毒症的病情发展遵循一定的免疫动力学变化规律，不同阶段免疫状态不同。脓毒症通过改变维持机体自稳态的效应细胞的存活时间、生成产物及细胞功能等多方面造成对机体的免疫系统损伤［6］。以往观点认为，脓毒症早期死亡是炎症反应过剧导致的免疫损伤所致的多器官功能衰竭，早期死亡可发生在数小时至数天内，甚至更短时间。后期死亡则是代偿性抗炎反应介导免疫损伤所致的器官功能衰竭和严重免疫抑制所致的继发严重感染，可发生在数天至数周后。但是近年来通过对脓毒症患者组织标本的基因分析发现，在脓毒症过程中，源于机体先天性免疫系统的功能紊乱和获得性免疫系统的免疫抑制使炎症反应和抗炎反应同时发生失衡并持续存在，进而造成持续和（或）反复感染，以及器官功能持久损害，导致患者死亡；炎症与抗炎反应，机体先天性与获得性免疫系统发挥同等重要作用。
1.1　高炎症反应状态　机体发生脓毒症时，早期呈高炎症反应状态（hyperinflammation）。当宿主不能将感染限制于局部，则整个机体暴露于病原微生物、病原成分以及坏死组织产物中。免疫细胞通过普遍存在于细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原和坏死组织，介导炎症反应并启动脓毒症样网络反应。病原体或无致病性微生物上能够被PRRs识别的结构称为病原相关分子模式（pathogen associated molecule patterns，PAMPs）。PAMPs被PRRs，如Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、C型和甘露聚糖结合凝集素受体、NOD样受体、RIG-I样受体等识别，介导树突细胞（dendritic cells，DC）、单核-巨噬细胞、中性粒细胞等先天性免疫细胞吞噬致病微生物，清除致病原。坏死组织所释放的蛋白和细胞产物，如线粒体DNA、热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1， HMGB1）等所构成的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），也类似地被PRRs识别。脓毒症过程中的机体先天性免疫系统被免疫激活，固有免疫细胞过度活化，导致严重而持久的炎症反应，表现为大量细胞因子和炎症介质如白细胞介素（IL）-1、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等短时间内爆发性大量失控性释放，称为 “细胞因子风暴”和“炎症介质瀑布”［7］。补体、 血小板激活因子被激活， 网状内皮系统等多个系统也参与此过程， 促进机体对病原的正常免疫反应转变为超强而广泛的炎症反应， 导致严重的组织损伤［8-9］。大量组织细胞损伤坏死后， 释放至细胞外的组织细胞内成分DAMPs被PRRs识别， 又加剧了炎症反应过程。过度的细胞因子和炎症介质释放持续时间取决于患者年龄、 并发症、 病原体毒力等， 一般维持数日。

值得注意的是，高炎症反应并非单独存在，炎症反应同时，机体启动代偿性抗炎反应（compensatory anti-inflammatory response），IL-10等抑炎因子释放，以期抑制TNF-α等前炎症因子所致的过强的促炎反应，从而下调炎症反应强度，减低失控性炎症反应对机体的损害［10］。在此阶段，若给予大剂量激素打压炎症反应，容易造成免疫抑制，形成代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS），使机体进入严重的免疫抑制（immunosuppression）或免疫麻痹（immunoparalysis）状态，并进一步导致难以控制的严重继发感染和院内感染。
1.2　混合性免疫状态　脓毒症短时间如未能控制，即可发生混合性免疫状态，即免疫紊乱。脓毒症免疫反应启动后一段时间（数小时至数日），机体高炎症反应状态的细胞因子级联放大反应开始下调，随炎症反应而启动的代偿性抗炎反应仍在持续，抑制IL-6、γ-干扰素（interferon gamma，INF-γ）的生成，刺激可溶性TNF受体和IL-1受体拮抗剂的生成，中和前炎症因子TNF-α和IL-1的促炎作用。此时，炎性损伤减轻，但抗炎因子对机体的损伤在加重，免疫失衡出现3种转归：（1）免疫状态回归平衡：机体经过外源性或自身调节，免疫状态逐渐回归平衡，疾病好转。（2）混合性免疫状态：机体炎症机制和抗炎机制僵持，平衡上调或下调，不平衡状态可向某一方面偏移，免疫混合性失衡呈多态性，疾病迁延不愈或持续发展，临床表现也呈现复杂性。（3）免疫抑制：因致病因素强或病情恶化致机体免疫损伤严重，免疫状态逐步转化为免疫低下（hypoimmunity）或免疫能力丧失，又称免疫麻痹。此时，机体丧失对外源性病原的免疫能力，继发严重感染而致死亡。对脓毒症免疫动力学的亚细胞水平研究显示，免疫细胞通过吞噬作用包裹病原成分、坏死的细胞器和细胞蛋白并运至溶酶体降解，从而清除PAMPs和DAMPs，减轻机体的炎症反应。正常情况下，病原体被杀灭后，坏死的组织细胞和白细胞发生凋亡，被巨噬细胞吞噬，从感染部位清除，并触发抗炎反应释放炎症抑制因子IL-10和转化生长因子β（transform growth factor β，TGF-β）。多种免疫调控细胞如调节T细胞（regular T cells，Tregs）、髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）相互协调，抑制炎症介质和细胞因子生成及其细胞毒性作用［11］。最新研究发现，生物活性脂类如脂氧素（lipoxins）、消退素（resolvins）、保护素（protectins）等能减少活性氧族（reactive oxygen species，ROS）、降低毛细血管通透性和白细胞募集，并增加巨噬细胞吞噬能力，从而达到减轻炎症损害的效果［10-11］。

严重感染后的免疫混合状态并非单纯抑制细胞因子和炎症介质释放的简单过程，而是一个由多种细胞及分子交错反应、相互竞争、相互协调而形成的复杂网络。炎症反应与抗炎反应之间的平衡状态决定了机体的免疫状态，平衡则可走向免疫稳态，失衡则导致机体自身免疫损伤和（或）免疫抑制。而机体抗炎反应过度活化，以及高炎症反应所导致的免疫细胞本身的损伤和凋亡，则可成为后期的免疫抑制和免疫麻痹的基础［12-13］。因此，混合性免疫状态使免疫平衡难以调控，这是脓毒症治疗难度大、病死率高的免疫动力学基础。
1.3　免疫抑制状态　脓毒症免疫动力学的负向极端是免疫的完全丧失，即免疫麻痹。随病情恶化性进展，免疫动力学进入免疫抑制状态。免疫细胞数量减少及功能下降是机体免疫抑制的表现。高炎症反应造成免疫细胞功能损害、过度凋亡、生存周期缩短，抗炎反应过度活化亦严重抑制免疫细胞功能。固有免疫中，中性粒细胞生存周期缩短，趋化能力减弱，无法达到感染部位发挥正常的杀菌效应，致使感染迁延。DAMPs 成分HMGB1、促炎因子TNF-α等可发挥促凋亡因子作用，介导巨噬细胞过度凋亡。树突状细胞（dendritic cells，DCs）出现数目下降及功能障碍，HLA-DR表达减少，过度分泌IL-10［14］。单核细胞表面抗原 HLA-DR/CD14＋表达下调，内毒素刺激后产生前炎症因子能力下降，形成内毒素耐受（endotoxin tolerance）［15］。自然杀伤细胞（nature killer cells，NK）CD16与CD56亚群改变，细胞毒性功能减弱，INF-γ生成能力减低［16］。获得性免疫中，淋巴细胞凋亡是造成免疫抑制的重要环节，存在固有的（Fas，FasL）和外来的（TNF）两条凋亡途径。新近研究表明，细胞外组蛋白释放可促进淋巴细胞凋亡［17］。T细胞过度凋亡、增殖能力下降及细胞亚群分化失调，呈现CD4+T细胞亚群向具有下调细胞免疫应答的Th2细胞优势分化，分泌抑制性细胞因子的调节T细胞亚群（regulatory T cells，Tregs）比例增加，循环中能产生INF-γ、IL-17的γδ T细胞的数量减少，均严重削弱了T细胞的免疫应答功能［18-19］。各亚型B细胞数目全面下降，尤其CD5+B1a型B细胞数目下降，炎症因子及IgM生成减少，细菌清除能力差，与脓毒症患者反复、持续感染及革兰阴性菌感染密切相关。先天性反应激活（innate response activator，IRA）B细胞具有分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage-CSF，GM-CSF）功能，其损害导致细菌清除障碍，细胞因子风暴增强，以及脓毒症休克症状的持续存在［20-21］。

脓毒症导致的后免疫抑制很严重，应引起足够重视。根据17个区域性研究提供的数据， 成人脓毒症存活患者出院1年内病死率在3%～43%［22］。另一研究显示，严重脓毒症存活者出院2年内病死率达44.9%，高于在院病死率的1.5倍［23］。笔者曾经治过的一些严重感染病例，治愈出院，3～4个月后再次感染来诊，最后不治死亡。通过对脓毒症存活及出院后死亡患者免疫状态的研究发现，免疫抑制和免疫麻痹是导致死亡的主要原因。此类患者的共同特点为持久的炎症-免疫抑制分解代谢综合征（persistent inflammation-immunosuppresion catabolism syndrome，PICS）及多脏器功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），表现为机会性感染、反复或持久感染、院内感染、多脏器功能衰竭甚至死亡［24］。一项纳入 235 例脓毒症死亡患者的研究显示，在疾病后期，绝大多数患者由于发生了未能有效控制的条件致病菌感染而死亡［25］。Arens等［26］对出院9～60个月的儿茶酚胺抵抗性脓毒症患者的前瞻性横向研究显示，炎症指标C反应蛋白（CRP）水平虽低，但较对照组增高，PCT轻度增高，提示脓毒症后期机体处于长时间的低等级慢性炎症状态；与对照组相比，脓毒症存活者更多发生机会致病菌、真菌及下呼吸道感染，单核细胞TLR5表达下降，先天性免疫和获得性免疫应对激活物刺激释放细胞因子的能力均减弱。对脓毒症死亡患者的尸检发现，先天性免疫和获得性免疫细胞均呈现明显凋亡。一项对74例严重脓毒症或脓毒症休克患者的研究发现，患者外周血MDSCs 增加，抑制HLA基因表达，T细胞与其共同孵育后，细胞因子分泌减少［27］。有人在脓毒症患者死亡后 30～180 min 内以内毒素刺激脾、肺组织，发现促炎及抗炎因子的分泌均明显减少，抑制性受体程序性死亡分子（PD-1）表达上调，Tregs数目明显增加，HLA-DR活化通路下调，提示机体呈免疫抑制状态。

上述研究均提示，脓毒症后期免疫功能抑制的存在是造成脓毒症远期并发症及死亡的主要原因。深刻认识免疫抑制的发病机制、探寻预防和解除免疫抑制的治疗方法，是提高脓毒症后期患者生存率、改善生存状态的关键所在。

2  脓毒症免疫抑制的应对策略

2.1　减轻早期失控性炎症反应　控制早期失控性炎症反应是预防脓毒症免疫抑制的基础。迄今为止，对于脓毒症免疫抑制或免疫麻痹，尚无效果确切的特效治疗。因为脓毒症早期的高炎症反应状态所导致的免疫细胞损伤和凋亡是造成后期免疫抑制的基础，所以，在脓毒症早期下调失控性的炎症反应，减少免疫细胞损害和凋亡，就成为减轻免疫抑制的首要环节。

激素、非甾体类抗炎药物、TNF-α抗体、IL-1拮抗剂特异性等抗炎治疗效果均不尽如人意。及时发现和诊断脓毒症、早期合理使用抗生素清除病原、充分的液体复苏、改善微循环等，仍是缓解早期炎症反应的主要治疗方法。更需引起重视的是，要避免医源性免疫紊乱的发生，尤其是抗生素诱导脓毒症的发生。内毒素是脓毒症发病重要的始动因子。应用强力抗生素后，短时期内造成细菌大量死亡、裂解，内毒素从细胞壁上游离出来成为游离内毒素，与结合在细菌壁上的内毒素相比，其生物学活性大大增强。青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins，PBP）是存在于细菌细胞壁上的酶类，负责细菌的合成，也是β-内酰胺类抗生素的主要靶体，抗生素的抗菌作用依赖抗生素与PBP的亲和力。优先与PBP3结合的抗生素能导致细菌形成细丝，增加细菌表面积，使细胞壁的成分增多，从而可引起大量的内毒素释放。内毒素短期内的大量释放、活性增强，一方面触发更加强烈的炎症反应，另一方面引发代偿性抗炎反应过度上调，二者均可造成后期的免疫抑制，这对于处于免疫紊乱下的机体状态无疑是雪上加霜。因此，在脓毒症状态下需正确选择和合理使用抗生素。对存在感染证据、可疑感染，要早期应用；如未发现感染证据，应及时停用抗菌药物。应明确，抗生素只是控制病原体，并不能纠正脓毒症中的免疫紊乱；而免疫紊乱才是造成脓毒症器官损害和死亡主要原因，也是脓毒症治疗的核心。并且，抗生素在短时间大量杀灭细菌的同时，可造成内毒素的大量释放，上调炎症反应、激活抗炎反应，可加重免疫紊乱。因此，脓毒症状态下究竟应该如何使用抗生素，仍是值得深入思考和探讨的问题。

从机体内源性途径增强抗炎作用，减轻炎症损伤，为脓毒症治疗提供了新思路。生物活性酯类与脓毒症关系的研究已有进展，有研究显示，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸来源的脂类在感染早期即可增高，调节炎症反应，加强细菌清除。Delli等［28］最近报道一组新的宿主保护性脂类，命名为13系列消退素（13-series resolves，RvTs），它能缓解急性期炎症反应，促进宿主免疫功能的恢复。阿托伐他丁可以通过激活环氧化酶-2而增加RvTs的生物合成，从而加速缓解炎症反应。乌司他丁联合胸腺肽α1能使脓毒症患者28 d病死率由38.32%降至25.14%，90 d病死率由52.10%降至37.14%。他丁类药物可以通过多种内源性介质缓解炎症、促进内皮细胞功能，而不影响巨噬细胞的吞噬功能，有望成为脓毒症免疫调节的新方法。
2.2　免疫增强治疗　探索免疫增强治疗防治和减轻脓毒症免疫抑制近年受到关注。研究显示粒细胞集落刺激因子（ granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF ）和GM-CSF有增强免疫作用，其主要作用是刺激骨髓前体细胞增殖分化为粒细胞和单核-巨噬细胞，激活成熟的粒细胞和单核-巨噬细胞。多项重组G-CSF和GM-CSF 治疗脓毒症的临床研究也显示，虽然能缓解疾病严重程度、缩短机械通气时间及增加单核细胞HLA-DR，但不能改善患者28 d 病死率及住院病死率。在减少感染发生方面，G-CSF和 GM-CSF显示了明显的效果。一项汇集了12个临床研究的荟萃分析显示，G-CSF或 GM-CSF均可明显减少感染并发症的发病率；在儿童脓毒症免疫抑制患者中，淋巴细胞TNF表达增加、院内感染发生率下降［29］。因脓毒症免疫抑制死亡时间多在发病90d以后，也有研究者设想，如给予免疫抑制患者进行长期的G-CSF、GM-CSF，能否起到后期增强免疫、减少感染、提高生存率的作用？此设想仍有待进一步临床研究证实。

重组INF-γ在单核细胞HLA-DR表达下降的脓毒症免疫抑制患者中显示出修复单核细胞功能障碍、提高生存率的作用，还可修复能量损伤所导致的免疫麻痹，提高细胞免疫功能［30］。PD-1及其配体（programmed cell death protein-ligand-1，PD-L1）的抗体在动物实验及患者体外试验中能改善脓毒症诱导的免疫抑制，减少脓毒症淋巴细胞凋亡，提高患者免疫细胞的功能。IL-7通过上调抗凋亡蛋白BCL-2阻止淋巴细胞凋亡、提高外周血CD4+和CD8+细胞数量。

也有学者在对G-CSF、GM-CSF、INF-γ、抗PD-1和PD-L1、IL-7等联合免疫治疗进行实验性研究。但目前为止，上述免疫增强治疗均处于探索阶段，尚未得到确切的临床结果。
2.3　免疫代谢的调节　免疫代谢调节对免疫系统的生理功能密切相关。免疫调节需要精确的代谢和生物能量支持。有氧代谢、糖酵解、谷氨酰胺分解是免疫细胞最常见的能量代谢方式，并决定了免疫细胞的状态（静止、激活和炎症化）和功能。在正常情况下，免疫细胞主要通过线粒体氧化磷酸化及β氧化途径产生三磷酸腺苷（ATP）获取能量维持免疫自稳态［31］。受到外界刺激后，淋巴细胞的能量代谢方式迅速转变为无氧糖酵解，即沃伯格效应（Warburg effect），此时，ATP来源于细胞质内乳酸发酵的快速获能方式，而不是线粒体内丙酮酸氧化的低速率糖酵解。低氧诱导因子1a（hypoxia-inducible factor-1a，HIF-1a）和哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是能量代谢方式转换的主要驱动因子。动物实验发现，当髓特异性HIF-1a缺乏时，大鼠无法抵抗金黄色葡萄球菌感染，提示HIF-1a和糖酵解通量是脓毒症免疫应答不可缺少的部分［32］。而且，HIF-1a不止是驱动脓毒症免疫应答的代谢中间产物。曝露于脂多糖（LPS）后，巨噬细胞能量代谢自氧化磷酸化转为糖酵解并诱导IL-1β生成。葡萄糖载体1（glucose transporter 1，Glut1）上调糖酵解促进巨噬细胞前炎症基因表型表达。最近的研究显示，源自脓毒症免疫抑制患者、内毒素耐受的淋巴细胞普遍存在糖酵解和氧化代谢缺陷，这种情况持续至患者完全康复才能改善。在脓毒症后期患感染需要进入ICU治疗的患者，其血中调控糖异生和糖酵解的基因含量低于正常基线，而且，这种基因反应与发生继发感染入院在时间上是一致的。对于调节免疫细胞功能、转化、成熟等能量代谢关键点的深入认识，可望为脓毒症免疫抑制治疗开辟新的途径。
2.4　中医中药的应用　我国传统医学中，多种中药成分对脓毒症有抑制炎症反应、调节免疫紊乱、解除免疫抑制的效果。如中药提取物黄芪多糖是黄芪的主要活性成分，能增加B淋巴细胞的增殖分化，提高浆细胞的分泌，增加血清抗体浓度；诱导巨噬细胞产生细胞因子和炎症介质，提高炎症反应能力；诱导成熟DC分化，进而介导Th1优势亚群分化，增强T细胞免疫功能，对脓毒症免疫麻痹具有潜在的治疗价值。

脓毒症免疫抑制问题因其病死率居高不下，已引起高度关注。脓毒症的免疫动力学及其免疫抑制是极其复杂且涉及面极广的领域，未明了的问题和未探索清楚的机制很多，目前尚未有特效性应对方法，因此免疫抑制所致高病死率仍未得到有效解决。研究进展为我们提供了方向性的启示：即早期适当下调炎症，控制过度炎症反应，减轻其对免疫系统的损伤；中期调节免疫状态，改善免疫紊乱，既保障免疫防护力量，又减轻免疫抑制；晚期加强免疫支持，抗衡免疫抑制。

参考文献 (略)

（2017-05-16收稿）

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