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之前介绍了PCR相关的一些基础知识，今天我们继续，综合整理了10种常用的PCR方法。小编整理下来的感受是，PCR绝不是想象的那么简单。此文是长文，您准备好了么？ ▼ 热启动PCR（Hot Start PCR） 热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。热启动PCR主要借助一种酶的修饰物（如抗体、亲和配体、适体或化学修饰物）来抑制常温下DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR反应体系配制阶段引物与模板、引物与引物之间的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制，热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，而无需牺牲PCR反应的特异性。 当反应体系配制好后，在反应初始加热步骤，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活（图1）。激活时间和温度根据DNA聚合酶及热启动修饰物的不同而有所差别。对于某些聚合酶，激活和预变性合并成了一步。 图1. 基于抗体热启动技术的DNA聚合酶 降落PCR（Touchdown PCR） 另一种提升PCR反应特异性的方法是调整PCR循环的参数。在降落PCR中，前几个循环的退火温度设定为比引物的最高退火温度（Tm）再高几度[1,2]。较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物与模板形成的复合物，因此可以减少不希望出现的扩增。就这一点来说，较高的退火温度可减少非特异性PCR产物，在PCR起始阶段促进特异性的扩增。 虽然较高的退火温度可阻止引物二聚体形成和非特异性引物结合，但同时较高的退火温度会加剧引物与目标序列的分离，导致PCR的产量降低。为了克服这个问题，在开始的几个循环中，退火温度通常设置为每个循环降低1℃，以获得足量的预期扩增子。当退火温度降低到最佳温度时（通常比最低的引物Tm低3-5℃），剩余的循环都维持此退火温度。通过这种方法，在PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，而几乎不会出现非特异性的产物（图2）。 图2. 降落PCR。通过以较高的温度起始，再随着循环逐渐降低到最佳退火温度（黑色曲线），这种PCR方法可提升反应特异性（黄色曲线）。目标扩增子的产量（绿色曲线）相应的得到富集。 巢式PCR（Nested PCR） 巢式PCR是常规PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。在此方法中，需要设计两对引物：一对（外引物）在目标扩增区域的侧翼，而另一对引物（巢式引物）对应于所扩增DNA的准确区域。第一轮PCR的产物之后作为第二轮PCR的模板（图3）。 如果第一对引物（外引物）由于引物错配扩增出了非特异性产物，第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的另一个好处是这种方法有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。 快速PCR（Fast PCR） 在快速PCR中，通过缩减PCR步骤所需的时间来完成更快的扩增，而不影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于均有高扩增能力的DNA聚合酶，这种聚合酶在每次结合中可引入更多的核苷酸。高扩增能力的聚合酶可保持高扩增效率，而PCR延伸时间是Taq聚合酶（低扩增能力）延伸时间的1/2到1/3（图4）。通过将引物退火和延伸（如果温度仅相差几度）合并成一步，PCR反应时间可进一步缩短。这个方案也被称为两步PCR方案。 图4. 低扩增能力和高扩增能力的DNA聚合酶扩增3.8 kb人类gDNA片段的效果对比。使用两步PCR方案（退火和延伸步骤合并）。 当使用低扩增能力的DNA聚合酶（如Taq酶）扩增<500> 另一种快速PCR的调整方法为缩短变性时间，将温度升高到98℃。使用这种策略需要注意的是，不是高度热稳定的聚合酶在如此高温下容易变性。 直接PCR（Direct PCR） 直接PCR意指直接从样本中扩增目的DNA，而无需核酸纯化。直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在独特的缓冲液中裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了PCR实验流程，减少了动手操作的时间，同时可避免纯化步骤中DNA的损失（图5）。 推荐具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA释放到裂解液中，它们会抑制PCR反应。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受这些抑制剂，从而使直接PCR成为可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高灵敏度，因此可从未纯化样本中扩增微量的DNA。 高GC含量PCR（GC-rich PCR） 具有高GC含量（>65%）的模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。高GC含量序列同时也涉及二级结构。因此，高GC含量序列可使DNA聚合酶在扩增时卡住，从而影响了DNA的合成。 为了扩增高GC含量片段，双链模板必须分离，以便引物结合及DNA聚合酶读取序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是依靠PCR添加剂或共溶剂来帮助DNA变性（图6A），如DMSO。这些试剂通常会降低引物的Tm，所以退火温度也需做相应的调整。 高合成能力的DNA聚合酶由于其与模板的强结合能力，有助于高GC含量模板的PCR扩增（图6B）。高热稳定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR扩增，因为更高的变性温度（如98℃代替95℃）可促进解链和PCR扩增。 图 6. 扩增不同GC含量的人类gDNA片段。（A）使用低合成能力的DNA聚合酶扩增0.8 kb 76% GC含量的片段。DMSO量的增加有助于提高扩增特异性。（B）使用高合成能力的DNA聚合酶扩增7个不同GC含量的片段。仅在扩增70%和76% GC含量片段时使用GC增强剂。 多重PCR（Multiplex PCR） 多重PCR可实现在同一反应管中同时扩增多个不同的片段。多重PCR不仅意味着节约时间、试剂和样本，同时使得多个扩增子进行同时比较成为可能。
图 7. 单个PCR与多重PCR的比较。在单个PCR中，每个反应含有一个引物对来扩增一个目的片段。在多重PCR中，在同一个反应中使用多个引物对来扩增多个目的片段。 当一个反应管中存在多个引物对时，如在多重PCR中，非特异性扩增和扩增效率的降低是最关注的问题，因为反应的优化不可能针对所有的引物对和片段。因此，引物的设计至关重要，以减少错配引起的非特异性扩增。引物序列对于目标片段应该是独特的，且所有引物的Tm值差异应在5℃内。在进行多重PCR前，每个引物对应在单个反应中验证其特异性和扩增效率。而且，不同大小的扩增子应在凝胶电泳中可区分开，以便鉴定。除了引物设计和扩增子大小，热启动DNA聚合酶和特殊优化的PCR缓冲液对于多重PCR也是必需的，它们可有助于扩增的成功率和扩增的特异性。 图 8. 通过凝胶电泳比较单个PCR和多重PCR。此实验中使用Invitrogen? Platinum? Multiplex PCR Master Mix。 虽然多重PCR通常用于终点法PCR，但由于其在多重标记和检测中的能力，将其用于实时定量PCR也变得越来越流行。多重实时定量PCR也常用于遗传标志物的检测，用于身份鉴定。 长片段PCR（Long PCR） 长片段PCR通常指扩增大于5 kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用Taq DNA聚合酶（为了快速延伸）和高保真酶（为了准确度）的混合物。 随着高合成能力、高保真DNA聚合酶的发明，长片段PCR现在可在短时间内高准确性的完成。通过与一个强DNA结合蛋白的结合，聚合酶可获得高扩增能力，可在短时间内扩增长片段（如>20 kb gDNA片段）（图9）。初次之外，极高保真度（如>100xTaq）可确保长片段扩增的低错误率（表3）。
图 9. 使用高合成能力DNA聚合酶进行长片段扩增，从人类gDNA样本中扩增15 kb和30 kb的特异性片段。 当扩增>10 kb的片段时，PCR实验方案可能需要在以下5个关键位置进行适当优化：
反向PCR（Inverse PCR） 反向PCR起初设计用于确定临近未知区域的序列。反向PCR有助于研究一个基因的启动子序列；致癌染色体重排如基因融合、异位或转移；及病毒基因的整合。之所以称为反向PCR，是因为引物设计用于向两边延伸而不像常规PCR中朝着彼此延伸[4,5]。如今，反向PCR常用于定点突变，复制一个具有预期突变的目的质粒。 在研究基因组DNA未知序列的传统实验流程中，限制性内切酶消化和连接先于反向PCR，接着对PCR扩增子进行测序。对于gDNA消化，需选择一种限制性内切酶进行酶切以获得合适长度可自连的片段。同时，所选择的内切酶不应该切割已知序列，所以连接发生于侧翼的未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段以助于片段自连而非多个片段连接。 片段自连完成后，通过反向PCR扩增DNA的位置区域。获得的扩增子两端包含一部分已知序列。之后通过测序以鉴定临近已知序列的未知区域。 图 10. 使用反向PCR来扩增和鉴定临近未知区域序列。 定量PCR（Quantitative PCR） 由于序列扩增的产量依赖于模板DNA的量，所以PCR常用于对样品中DNA进行定量，常用的应用是基因表达的定量。终点法PCR是一种可能的方法，但其有较大的缺点，通过凝胶电泳来检测产量，检测的灵敏度非常有限。更重要的是，使用终点PCR是在PCR反应结束后进行定量，此时扩增已经达到平台期（图11），DNA凝胶染色的强度与DNA起始量不成线性关系。尽管如此，通过终点法PCR可以对基因表达进行半定量，可以使用一系列稀释程度不同的DNA样本作为模板起始量，或者在特定的PCR循环处获取扩增产物，然后通过凝胶显色强度来估计基因的表达量。 图 11. PCR扩增曲线或反映动力学。在终点PCR中，扩增子的检测是在反应达到平台期以后。在实时定量PCR中，扩增子的检测是在反应的指数期。 在1993年当Higuchi et al.发明使用荧光信号来实时模拟PCR扩增，基于终点法PCR定量的局限性得到克服解决。这种技术成为我们今天熟知的定量PCR的基础。1997年，首款qPCR仪器上市，使得可以发挥PCR的力量来准确定量基因的表达和拷贝数。qPCR依靠在对数期通过荧光强度来实时模拟目标基因的扩增（图11），避免了终点PCR定量的缺点。当qPCR用于基因表达的相对和绝对定量，由于检测能力有限，其仍然具有一定的局限性。 数字PCR的发明使得对DNA样本的绝对定量成为可能[11-13]。在数字PCR中，高度稀释的DNA样本被分散在多孔芯片中，使得每孔含不超过一个拷贝的目的基因。每孔内扩增的结果检测为阳性或阴性。通过使用统计模型（泊松分布）分析阴性反应的比例，从而来决定样本的拷贝数，无需已知样本作为标准来进行定量（图12）。除了基因表达和拷贝数检测，数字PCR也适用于诸如低频等位基因的辨别、病毒滴定和二代测序文库的绝对定量。
图 12. 数字PCR常用实验流程，用于绝对定量。 ▼ 总的来说，改进的PCR方法和改进的DNA聚合酶是为了提高PCR扩增的结果。虽然PCR的基础概念仍然没变，但新的PCR方法一直在推动和简化分子生物学研究。 赛默飞可提供完整系列的PCR产品，如需了解更多 ，欢迎点击“查看原文”链接。 参考文献： 1.Don RH, Cox PT, Wainwright BJ (1991) 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res 19(14):4008. 2.Hecker KH, Roux KH (1996) High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. Biotechniques 20(3):478–485. 3.Haff LA (1994) Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl 3(6):332–337. 4.Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics120(3):621–623. 5.Pavlopoulos A (2011) Identification of DNA sequences that flank a known region by inverse PCR. Methods Mol Biol772:267–275. 6.Raeymaekers L (1999) General Principles of Quantitative PCR. In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols. Totowa, NJ: Humana Press. pp. 31–41. 7.Siebert PD (1999) Quantitative RT-PCR. In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols. Totowa, NJ: Humana Press. pp. 61–85. 8.Higuchi R, Fockler C, Dollinger G (1993) Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions.Biotechnology (N Y) 11(9):1026–1030. 9.Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV (1997) The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques 22(1):176–181. 10.Applied Biosystems, Inc. (1997) Relative quantitation of gene expression: ABI PRISM 7700 Sequence detection system. User Bulletin #2: Rev B part 4304859B, 1–36. 11.Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ et al. (1992) Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques13(3):444–449. 12.Kalinina O, Lebedeva I, Brown J et al. (1997) Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res25(10):1999–2004. 13.Vogelstein B, Kinzler KW (1999) Digital PCR. Proc Natl Acad Sci U S A 96(16):9236–9241.  每天3分钟，跬步至千里 |
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