EntransterTM-R4000
（用于将RNA转染入动物细胞）
使用手册
一产品介绍
本品推荐用于将siRNA、microRNA(miRNA)、mimic、inhibitor等小片断RNA转染入动物
细胞（包括各种细胞系、原代细胞、悬浮细胞、昆虫细胞等）。
本品在多种细胞系的验证中均表现了很好的RNA转染效率，并有很低的细胞毒性，而较
低的细胞毒性对RNAi实验尤其重要。
二重要提示
1.由于本品细胞毒性很低，所以采用本品进行转染的细胞数量相对较少，这有助于提高
转染效率。
2.采用本品进行转染，RNA用质量(ug)进行计量，对21nt双链的siRNA来说，
1OD=3.0nmol=40ug。
3.siRNA等较短RNA请参照表1中siRNA用量，mRNA、shRNA等较长RNA请参照表1中
mRNA用量。
4.如转染后需要用Trizol提取RNA，建议转染后6小时换液。
三实验过程（以24孔板siRNA转染为例）
1.提前1天细胞种植
贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％
左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某
细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。
2.转染过程
⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，
终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
⑵取1ul的EntransterTM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成
EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。室温静置5分钟。
⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸
10次以上）混合，室温静置15分钟。转染复合物制备完成。
⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后
移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到
结果。
注意：1.siRNA转染后，继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果，继续培养24-96小时在蛋白水平得
到结果。mRNA转染后，根据需要在24小时后得到结果。
2.在部分实验室，由于血清和培养条件等差异，转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀，为转
染试剂和血清中蛋白结合产物，不影响转染结果和细胞状态，可通过换液除去。
表1不同细胞培养容器转染推荐用量
细胞培养容
器
表面
积
(cm2)
共享试剂siRNA等较短RNAmRNA，shRNA等较长RNA
培养基
总量
稀
释
液
体
积
siRNA
用量
EntransterTM-R4000mRNA用
量
EntransterTM-R4000
96-well0.3100μl10μl0.15μg0.25μl0.25μg0.375μl
48-well0.7200μl15μl0.3μg0.5μl0.5μg0.75μl
24-well1.9500μl25μl0.67μg1μl1μg1.5μl
12-well3.81ml25μl1.33μg2μl2μg3μl
6-well/35-mm102.5ml50μl3.33μg5μl5μg7.5μl
60mm/T25
flask
215ml125μl6.67μg10μl10μg15μl
100mm/T75
flask
5815ml250μl20.0μg30μl30μg45μl
四优化
由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂
在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。下表列出了在24well的优化方
案，供参考。
RNA浓度和转染试剂量的优化(24well)
1234
RNA工作浓度25nM50nM100nM150nM
每孔RNA的量(pmol)0.17μg
(12.5pmol)
0.33μg
(25pmol)
0.67μg
(50pmol)
1μg
(75pmol)
每孔转染试剂量0.25μl0.5μl1μl1.5μl
根据优化实验结果，固定RNA(μg):转染试剂量(μl)的比值，按培养器皿表面积比例应用
到其他培养容器。
五常见问题与解决方案
问题可能原因解决方案
转染后沉默现
象不明显
RNA与转染试剂
比例不佳
预实验优化
细胞密度不佳调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%
RNA效率不高选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照
RNA酶污染建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等
材料和实验器具。
转染后培养时间
不够
在mRNA水平可以到48小时以后验证结果，在蛋
白水平可以到72小时后验证结果
细胞毒性RNA与转染试剂
比例不佳
预实验优化
细胞密度不佳调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%
培养基毒性采用含10-20%血清的全培养基
细胞污染建议彻底清洁所有细胞培养相关用品
|
|
