解读IF 23.394分杂志的LncRNA的研究套路——文献精读

 

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研究背景

肝癌（HCC）是一种常见的恶性肿瘤，与病毒感染，代谢疾病等密切相关。肝癌具有高复发性以及异质性，肝癌干细胞可能参与肝癌的两大组织学特性，但具体机制尚未可知。

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寻找差异

首先，作者通过转录组芯片鉴定了人肝癌干细胞和非干细胞中差异表达的长链非编码RNA，发现有286 非编码RNA 在人肝癌干细胞中异常表达 (Figure 1A)。

由于lncRNAs一般作用于临近基因。作者重点寻找位于干细胞转录因子或者与干细胞信号通路相关编码基因临近的lncRNAs，发现lncTCF7在人肝癌干细胞中高表达，且位于人类第五号染色体，介于HSPA4与TCF7基因间 (Figure 1B)。

作者进一步证实lncTCF7在人肝癌干细胞系以及三株肝癌细胞系中高表达(Figure 1C- 1E)。

同时验证发现lncTCF7在肝癌标本中显著高于正常组织与肝硬化组织(Figure 1F）。

然后作者进行northern blot发现lncTCF7长度介于500-1000bp之间(Figure 1G)。通过RNA-FISH与细胞分流实验，作者发现lncTCF7 定位于肝癌细胞核中 (Figures 1H and 1I)。

以上实验证明lncTCF7, 在lncTCF7在人肝癌干细胞和肝癌组织中显著高表达

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表型研究

作者通过慢病毒SHRNA的方式敲减肝癌干细胞中lncTCF7 的表达(Figure 2A)，发现lncTCF7 的敲减显著显著下调肝癌细胞重要干性转录因子Sox2 、Nanog、Oct4的表达(Figure 2B)。敲减lncTCF7，不仅显著减少CSCs的形成 (Figure 2C)，更重要的是，lncTCF7的缺失损害体外干细胞小球的形成能力(Figure 2D)。

在肝癌细胞系中敲减lncTCF7 的表达，肝癌细胞重要干性转录因子Sox2 、Nanog的表达也显著降低(Figure 2E)。然后作者在裸鼠皮下接种稳定敲减lncTCF7细胞，发现敲减lncTCF7抑制肿瘤形成 (Figure 2F)，肿瘤的自我更新能力以及肿瘤增殖也受到抑制(Figures 2G and2H)。

以上实验证明敲减lncTCF7会破坏肝癌干细胞的肿瘤形成能力

作者通过构建LncTCF7稳定高表达肝癌细胞系（Figure 3A），发现显著促进了肝癌干细胞的自我更新能力(Figure 3B)。肿瘤成球能力以及肿瘤形成能力增强 (Figures 3C and 3D)。lncTCF7 过表达显著促进肿瘤生长(Figure 3E) 以及肿瘤发生频率 (Figure 3F)。

以上实验证明lncTCF7 在肝癌干细胞肿瘤自我更新能力中起到重要作用

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探究机制

作者通过对lncTCF7敲减细胞株的转录组分析发现并验证TCF7 编码基因以及Wnt信号通路靶基因显著下调(Figure 4A -4C)。lncTCF7过表达显著上调TCF7编码基因以及Wnt信号通路靶基因。提示lncTCF7主要通过调控TCF7而活化Wnt信号通路。

为了验证lncTCF7主要通过调控TCF7参与肿瘤自我更新能力，作者在lncTCF7敲减细胞株中进行了TCF7的挽救实验(Figure 4E)，发现干细胞小球的形成能力恢复(Figure 4F)。

为了探究TCF7在肝癌中的临床意义，作者发现与癌旁组织相比，TCF7在肝癌肿瘤中高表达(Figure 4G)。此外发现TCF7主要定位于肝癌细胞核内(Figure 4H and 4I)。TCF7的高表达，患者五年生存率降低(Figure 4J)。

以上实验证明lncTCF7 调控TCF7 的表达参与激活Wnt信号通路,导致肝癌干细胞的自我更新作用增强，加快肿瘤进程

作者通过RNA pull-down 实验寻找lncTCF7结合蛋白。研究发现lncTCF7可以结合SWI/SNF复合体三个重要组成部分：BRG1, BAF170, SNF5(Figures 5A and 5B)。其中lncTCF7与SWI/SNF 复合体的结合经RNA免疫共沉淀进一步证实(Figure 5C)。

然后作者进行一系列的lncTCF7的截断模型寻找与SWI/SNF复合体结合位点(Figure 5F)，发现lncTCF7 3’端468至683位点能够结合BAF170, BRG1, SNF5 (Figure 5F)，并且通过EMSA实验进一步证实与BAF170的结合 (Figures 5G and 5H)。

以上结果证明，lncTCF7可以招募结合SWI/SNF复合物

由于SWI/SNF复合物可以调节基因转录与染色质重塑。作者发现lncTCF7的敲减可以抑制BAF170与TCF7启动子区域的结合(Figure 6A)。荧光报告实验证实1,200-1,100 bp是BAF170与TCF7启动子区域的结合所需位点(Figures 6B–6D)。研究发现BAF170缺失可以导致肿瘤干细胞Nanog基因的表达下调(Figure 6G)，同时下调WNT下游基因Sox2,CCND1以及CCND2的表达。BAF170的敲减也显著降低肿瘤形成能力以及抑制肿瘤生长（Figures 6I–6K)。

综上所述，lncTCF7通过招募SWI/SNF复合物，激活Wnt信号通路，在肝癌干细胞自我更新的维持中发挥重要作用

最后，通过模式图回顾一下lncTCF7调控肝癌干细胞自我更新机制: lncTCF7通过招募SWI/SNF复合物，结合在TCF7启动子区域，启动TCF7基因的转录，激活Wnt信号通路，在肝癌干细胞自我更新的维持中发挥重要作用。

研究提示lncRNA可以作为肝癌发生发展的重要分子，可能将成为肿瘤临床干预的重要新靶点。

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