——日读一帖,解螺旋大V团队伴你科研路 【科研热点】让你时间比别人花的少、知道的比他早! 【基金专栏】国自然等各项基金独到经验见解 【SCI 专栏】从开始到接收全程tips 【实验技能】这么棒快告诉你老板! 关注我们,为您的科研路提速 作者:罗雨豪 张菲菲 单位:广州南方医科大学南方医院肿瘤科; 广州南方医科大学基础医学院病理学系 导读:眼见实验室刚来的师妹们都拜倒在大师兄的威信之下,每天跟着后面屁颠屁颠的学实验,一边学还一边投去羡慕崇敬的目光:“师兄,你好厉害,PCR条带好亮”“师兄棒棒哒,western blot杂出来了,而且还好干净”······这样下去怎么得了!看来我得拿出杀手锏,组会上秀秀免疫荧光的高大上照片来巩固一下自己的地位,哈哈。怎么让大家像我一样立马在实验室狂拽炫呢?我们今天就来跟大家分享一下免疫荧光相关的实验经验! 简介:免疫荧光(immunofluorescence)技术是在免疫学,生物化学和显微技术的基础上建立的一项技术,再用荧光抗体(或者)抗原作为探针检测细胞或组织内相应的抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光在细胞或者组织的表达,从而确认抗原或抗体的性质和定位。常用的方法有直接法和间接法。
鉴于目前间接法的应用比较多,今天就给大家谈谈怎么用间接法做出让人心动的图,不多说了,直接上硬菜。 操作步骤: 1、调养好细胞状态,于前一晚种植与六孔板,若是用于转染质粒,推荐种植密度为90%~95%,若是干扰片段或者microRNA的mimics等推荐种植30%~50%密度 2、铺板后24小时内转染,超过24小时转染效率欠佳,90%~95%密度一般Lip2000加10ul/孔,而30%~50%加5ul/孔,目的基因或片段根据样品说明书决定 3、转染24小时后将细胞用胰酶消化,种植于激光共聚焦小皿,若需要拍包膜表达的蛋白,密度可稍微高一点(60%~75%),若普通胞浆或胞核蛋白则密度低一点(20%~40%),很多同学担心铺皿后会被碰翻,有个小技巧可以推荐给大家,将皿置于洁净的六孔板中,对,你没听错,就是常用于细胞转染的六孔板,一方面可以起稳固作用,另一方面六孔板密封性良好,减少污染的可能 4、铺皿24小时后,吸去培养基,过滤级PBS清洗2遍 5、4%的多聚甲醛固定15min,每个皿200ul~300ul 6、过滤级PBS清洗3次,每次5min,可上摇床 7、0.5%Triton破膜穿孔,一般胞浆蛋白或胞膜蛋白10min,胞核蛋白13~15min 8、过滤级PBS清洗3次,每次5min,可上摇床 9、吸净PBS,山羊血清或0.5%BSA封闭30min,个人偏好于用山羊血清封闭 10、吸净山羊血清,一抗(5%BSA稀释)4度孵育过夜 11、室温静置孵育30min,吸去一抗,过滤级PBS洗3次,可上摇床 12、吸去PBS,二抗(5%BSA稀释)室温杂交1小时,从此步起后面所有操作需避光 13、吸去二抗,过滤级PBS清洗3次,可上摇床 14、吸去PBS,DAPI(甲醇稀释)染色5min 15、吸去DAPI,过滤级PBS清洗3次,可上摇床 16、上机检测
如何做免疫荧光共定位 有同学想同时检测两个蛋白在细胞里的表达,看是否存在共定位现象,以此判断是否有可能存在相互作用。共定位操作基本与以上步骤一致,需要改变的是如下几步:步骤10中,需同时加入两种蛋白的一抗,而且必须是不同种属的抗体,比如我抗体A为鼠抗,那么抗体B就不能是鼠抗,常用的是兔抗。步骤12中,需同时加入两种特异性二抗,而且标记的荧光不能一样,比如加入山羊抗鼠的红光和山羊抗兔的绿光,这样若存在共定位,Merge后会出现黄光。 常见问题: 1、为什么我的镜下观察只有DAPI的蓝光,目的荧光几乎没有或者很弱?如图: 答:出现这种现象很有可能是抗体比例太低,需提高抗体浓度,可配合提高二抗浓度;共聚焦的激发荧光强度不够大;二抗孵育时是否是对应的种属,比如本来需要山羊抗鼠结果加为山羊抗兔 2、为什么我的细胞核周围总是存在有一些蓝色的小点点?比如: 答:此种情况一般是支原体污染所致,建议用杀支原体药2周后再检测,或者通过提高共聚焦机器背景值来覆盖支原体荧光 3、共定位的视野该如何选择? 答:共定位时,首先判断哪些细胞是转染成功的,比如我过表达了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位关系,则在视野中寻找已成功转染蛋白A的细胞,一般荧光强度会显著高于周边其他细胞,再在这个细胞上观察蛋白B的表达,如图: 4、视野中细胞与细胞之间存在散在的发光点,如图: 答:有两种情况可造成:1,拍照时PBS量过少引起的非特异性;2,PBS未过滤,未溶解的残渣黏附而导致 优秀作品展: 心得体会:骚年们,心动不如行动。学好免疫荧光是高大上实验必备技能,当你的美图呈然纸上,就是萌妹子在你耳边高声的唱:“就这样被你征服。。。”的时候! |
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