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经常有人在我们文章留言说自己的细胞在培养过程中发生了什么问题？该怎么办呢？向我们求助，希望帮忙解决问题！但由于这些不是一两句话就能解决的事情，所以我一般建议科研君们加我们技术支持的QQ，为了更加方便地为大伙们解决问题。 今天，针对在培养细胞的过程中有可能影响细胞状态的各个因素进行解说一下，感兴趣的亲可以详细看看。 前言 细胞培养实验中，经常会遇到很多问题，为解救细胞，就得对症下药才行。一般细胞出现问题的原因可以从5个方面来着手。只要抓住这5点，救细胞就是小case。  细胞自身问题 种子好不好很重要 如果你使用的细胞已经是很多代之后的了，培养的时候就会力不从心，可以重新复苏更原始的细胞进行培养。
如果你使用的是冻存的细胞，那就有可能在冻存时该细胞的增殖能力就很弱了，可以通过查看以往的操作记录来判断。 还有一点就是个体差异，可以在培养前通过已知的标准对样本进行筛选，从而减少个体差异带来的影响。 外源污染 如果相同来源的其它批次的细胞并没有出现问题，你就要思考一下你是不是“中奖了”。请及时对可疑细胞以及培养使用的试剂进行隔离。  细菌污染 细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米(μm)计。 常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。 一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h可得结果。 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。   解决方案： (1) 丢弃所有已经污染的细胞和培养基； (2) 培养环境用新洁尔灭擦拭且UV灭菌24小时； (3) 培养试剂中加入P/S双抗； (4) 尽可能使用一次性耗材及成品培养基； 真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。 污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。 霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。  解决方案： (1) 丢弃所有已经污染的细胞和培养基； (2) 培养环境用甲醛熏蒸； (3) 培养试剂中加入两性霉素B； (4) 尽可能保持细胞培养环境的干燥； (5) 注意戴帽子和口罩； (6) 尽可能使用一次性耗材及成品培养基； 支原体污染 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2μm并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。
解决方案： (1) 丢弃所有已经污染的细胞和培养基； (2) 使用支原体清除试剂擦拭培养箱及超净工作台； (3) 培养试剂中加入支原体清除试剂； (4) 注意戴帽子和口罩； (5) 尽可能使用一次性耗材及成品培养基； 黑胶虫污染 黑胶虫可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。数量不多的时候对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。 原虫污染 培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。 病毒污染 组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。 交叉污染 共用试剂、耗材，同时操作不同的样本，都极易造成交叉污染。交叉污染之王应该属于HeLa细胞了，世界上已有很多细胞都受其污染，致使许多实验宣告无效。 实验设备 细胞培养用的超净台、细胞培养箱，最好买比较好的品牌。但是别以为买了大公司的仪器就可以高枕无忧，设备最好要定期检修的，比如超净台的过滤膜要定期更换，有时培养箱上的显示器明明显示二氧化碳浓度为5%，其实际情况却可能已经＜5%了。
仔细观察细胞培养液的颜色，如果培养液偏紫红，那可能是培养箱中二氧化碳浓度不达标导致PH值偏碱，最好及时更换培养环境，重新调试培养箱。 试剂 在细胞培养实验中，如果出现使用同批次试剂培养的细胞大部分都出现问题情况，就需要锁定是否是试剂的问题导致的。 首先我们应该先要检查试剂的规格、效价是否与之前一致，如果有改变则需根据情况修改加入的量； 然后我们要检查试剂的品牌是否与之前一致，如果有更换应验证该品牌是否能适用于这类细胞。 最后我们要检查试剂的有效期是否过期、存放位置是否有问题、是否反复冻融等，以免试剂已因此而失效。 总的来说，就是要选对试剂、买真试剂、验证好试剂、保存好试剂、正确使用试剂。要购买正品的试剂，可以选择广州安邦生物科技有限公司噢！ 操作问题 对于操作问题我们不应回避，其实很多实验出问题都是操作不当导致的。对于严谨的实验来说，真是细节决定成败。  细胞培养是一个不断进步的过程，要想成为达人，看几篇文章哪够？在平时做好积累，量变才会有质变。 如果这篇文章还不能解决您的问题，可以看公众号的底部端口，并点击细胞培养，进入查看更多的细胞培养小知识。 |
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