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背景：在过去10年间靶向疗法显著改变了癌症的治疗。但是，由于肿瘤异质性、克隆进化和选择问题，几乎所有肿瘤都会对系统治疗产生抗性。虽然基因分型目前被广泛用于肿瘤分类以进行临床决策，但是肿瘤组织只提供了点滴信息，或者通常难以获得。为了克服这些问题，需要一些方法在病程期间各个时间点鉴别生物标志物；鉴别不仅要快速，成本效益高，还要非侵入性。因为无细胞循环肿瘤DNA（ctDNA）可能代替整个肿瘤基因组，ctDNA用作液体切片可能有助于获得急需的遗传随访数据。 内容：本文包含了近期探索ctDNA作为液体切片在癌症中的潜在诊断、预后和预测作用的研究。另外，还涵盖了生物学和技术层面，包括DNA分析的分析灵敏度和准确度最新进展以及在临床常规实践中实施之前必须克服的障碍。 总结：虽然ctDNA分析是一个有前景的领域，而且为了开发适当工具全面分析血浆DNA肿瘤基因组做出了所有努力，液体切片仍未在临床常规应用。需要达到分析前和分析程序一致性，以提供临床标准在精心设计和足够权威的多中心研究中确认液体切片可以作为临床生物标志物。 很多癌症类型的临床后果可以通过鉴别其发病机理之下的分子事件来改善。通过使用所谓的生物标志物，根据肿瘤的遗传组成调整治疗方法。肿瘤基因分型是一种通过对肿瘤分类做出临床决策的可能方法，而且可能鉴别出对多种药物反应的患者。 近期，新的生物标志物发现获得了实质性的进展，比如表皮生长因子受体（EGFR）和鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS）激活突变以及v-erb-b2鸟类成红细胞白血病病毒癌基因2（ERBB2）和棘皮动物微管相关类蛋白4与间变性淋巴瘤激酶（EML4–ALK）融合基因扩增。包含这些突变的癌症对特异性靶向抑制剂敏感。由于大规模癌症基因组测序研究以空前的速度阐明了新型癌症相关突变，并且我们对于这些遗传学改变的功能后果的了解快速增加，更多的生物标志物将出现。 尽管在过去10年间靶向疗法显著改变了癌症的治疗，但是这些疗法带来了一些新的问题和挑战，包括肿瘤异质性和分子进化、活检（切片）的费用和潜在发病、大多数基因组变异缺乏有效药物、分析试验的技术局限性、报销和法规阻碍。其中最重要的生物学问题之一是瘤内异质性。由于肿瘤异质性、克隆进化和选择问题，不管用何种疗法，几乎所有肿瘤都会产生抗性。Gerlinger等人在多肿瘤抑制基因中发现极大的异质性，这可能会造成影响，尤其是对同期转移癌患者，因为在大多数情况下，只能做活检而且治疗决策取决于单个肿瘤活检的结果。因此，可能忽略相关病变（图1）。此外，在大多数情况下活检难以获得，无法获得转移瘤的遗传组成信息。因此，治疗决策常常是在不知道肿瘤遗传组成的情况下做出的（图1）。另外，肿瘤会进化并且在进展期间可能出现亚克隆，从而导致原发肿瘤与转移瘤或复发瘤之间的特异性变异比例和模式差异。此外，研究表明转移瘤不一定比其原发肿瘤复杂，例如，转移瘤可能失去原发病变存在的变异（图1）。由于肿瘤存在极大的异质性而且我们缺乏对肿瘤遗传组成的认识，原发性耐药或继发性耐药的原因尚不清楚。因而，既然治疗相关标志物在肿瘤进展期间可能改变，那么多个时间点的标志物研究可能提供关于患者管理的重要信息（图1和2）。对肿瘤基因组进行连续采样来监测治疗效果应该是个体化治疗的先决条件；然而，由于连续活检对于患者来说通常是一种负担，因为活检具有侵入性，所以这种做法目前几乎是不可行的。另外，有人提出某些活检会使肿瘤播散，但是这是非常罕见的事件。总而言之，虽然无创程序可能带来潜在风险，但是当前的替代治疗方案具有不可接受的毒性而且将进行性疾病基于通常不是非常准确的临床参数，即放射学影像和/或测量。 为了克服这些问题，需要一些方法在病程期间各个时间点（在诊断，和治疗期间的确定区间）鉴别生物标志物；鉴别不仅要快速，成本效益高，还要非侵入性。克服重复采样局限性的一个方法是分析循环肿瘤细胞（CTCs）和/或无细胞循环肿瘤DNA（ctDNA）。近期有关ctDNA和CTC分析的进展能够通过无创手段监测肿瘤基因组。多项研究表明可以重建血浆NDA的肿瘤基因组。肿瘤细胞将DNA片段释放到循环中，这些片段和正常细胞的DNA片段[无细胞DNA（cfDNA）]都可以在血液的无细胞部分发现。由于ctDNA可能代替整个肿瘤基因组，所以它被称为“液体切片”。因为最佳治疗管理倾向于在整个肿瘤基因组的现状基础上做出决策，ctDNA用作液体切片可能有助于获得急需的遗传随访数据。本文涵盖了生物学和技术层面，以及cfDNA对癌症诊断学产生广泛影响的挑战。由于这是一个不断发展的领域而且cfDNA的数据很多，我们不能包括这个特殊领域的所有现存研究。
图1：液体切片用于监测治疗效果和抗性 假设一名转移性乳腺癌患者的病程。一线治疗基于原发肿瘤的活检，相关转移变化可能漏掉从而导致原发耐药。转换成二线治疗后，继发耐药出现。可以用液体切片分析抗性克隆的遗传变化，因此在临床进展显著之前可能发现耐药机制。
图2：液体切片用于监测肿瘤特异性变异以检测复发 假设一名乳腺癌患者的病程。原发肿瘤治疗切除后，很长一段时间可能没有临床疾病证据。但是，可能在临床发现肿瘤复发之前很久就在循环中检测到肿瘤特异性DNA。另外，肿瘤特异性变化可用于鉴别高危复发患者。 无细胞DNA通过凋亡或坏死细胞的多种机制，从不同的肿瘤部位和健康/炎性组织释放出来。肿瘤来源DNA（ctDNA）可从血浆中提取出来而且各种肿瘤特异性遗传变化可被检测到。但是，肿瘤特异性DNA的数量变化相当大（从<1%到>90%），很多ctDNA分析技术被提出。液体切片可在各种临床情况下应用，包括癌症诊断、最小残留疾病检测、预后和治疗监测。WGS，全基因组测序。 生物学层面 cfDNA最初由Mandel和Me´tais在健康个体的血液中发现。但是，他们的创举没有引起充分注意，直到30年后Leon等人报道了癌症患者血液循环中cfDNA的浓度增加。又过了10年后，Stroun等人证明了血液循环中存在肿瘤特征。这些发现后来得到其他一些研究小组证实，随后这些年肿瘤特异性变异，包括肿瘤抑制基因和致癌基因、微卫星不稳定性（MSI）、和DNA甲基化分别被鉴别出来；它们提供了确凿的证明，表明cfDNA通过肿瘤释放到血液循环中（图3）。 几乎没有cfDNA释放到血液循环的实际动力学数据，对其来源、机理和释放速率的认识通常也是矛盾的。cfDNA被认为有不同来源，包括凋亡和坏死细胞（图3）。有些报道表明肿瘤的恶性质导致更大程度的坏死，这与循环肿瘤DNA增加是一致的。Diehl等人认为在血液循环中发现的DNA片段来源于被巨噬细胞吞噬的坏死肿瘤细胞。最近Sikora等人的一项研究显示，在胰腺导管腺癌、胰腺神经内分泌瘤和慢性胰腺炎患者中几乎检测不到较大的坏死来源的DNA片段。或者，所有活细胞主动释放DNA到血液循环中。然而，Lo等人利用孕妇血浆DNA的全基因组测序，证明了血浆DNA分子表现出可预测的裂解（片段化）规律，使人联想到核酸酶裂解的核小体。通过评估cfDNA在健康个体和癌症患者中的大小分布证明了这一发现，评估揭示了单个或多个核蛋白复合体大小的片段富集和释放的主要原因可能是细胞凋亡（图4）。从小鼠实验获得更多细胞凋亡作为cfDNA主要来源的证据，结果表明移植瘤动物血浆中的主要片段来源于单核小体。作者证明了ctDNA特征在裸鼠（被移植了人CRC细胞系HT29或SW620）的结肠直肠癌（CRC）肿瘤生成期间不断变化。虽然ctDNA在早期已经可以检测到，但是最终肿瘤的大小与可检测到的cfDNA浓度没有显著相关性。Mouliere等人对cfDNA的大小分布做了深入研究，结果显示移植瘤小鼠和癌症血浆样品中肿瘤来源的ctDNA具有特定的ctDNA大小分布图和明显较高的ctDNA片段化。这一发现被Garcia-Olmo等人的研究证实，他们证明了释放到血浆中的正常和肿瘤DNA似乎与个体特异性因素相关，肿瘤DNA对突变和非突变DNA浓度的影响随着时间波动。同一研究小组提出血浆中的cfDNA可能参与肿瘤形成，和通过易感细胞类转染（transfection-like）吸收这些核酸形成转移瘤的过程。补充KRAS突变患者的血浆导致鼠科NIH-3T3的致癌性转化，这个过程称之为基因组转移（genometastasis）。近期一项研究介绍了用原子力显微技术首次目视测定 CRC患者和健康献血者血浆样品的cfDNA ，结果又显示CRC血浆中80%以上的cfDNA片段都低于145bp，证实了通过凋亡机制产生很高程度的片段化。 图3：液体切片用作癌症监测工具的图示 此外，关于cfDNA稳定性的数据更少；但是，清除机制似乎很快，脾、肝和肾可能负责清除。据先前估算无细胞胎儿DNA（cffDNA）的半衰期是16分钟；不过，同一研究小组近期利用大规模平行测序（MPS）技术研究了cffDNA的动力学，结果显示在两阶段清除过程中，快速阶段的半衰期大约为1小时，第二阶段为13小时。使用MPS评估cfDNA的释放和清除动力学从两个方面来说对靶向疗法有益。首先，可以使用整个基因组，因此MPS不依赖于包含特异性基因位点的DNA片段。其次，MPS能够检测所有循环DNA片段，不管大小如何。然而，对癌症患者的血浆DNA清除机制所知不多，也不知道其他因素比如生物周期节律、炎症或特殊疗法如何影响释放和清除机制。循环Epstein–Barr病毒（EBV）DNA研究首先发现了等效机制的证据。 技术层面 由于片段化程度高和血液循环中浓度低，cfDNA是一种具有很大挑战的分析物。虽然如此，已证明血浆是比血清更好的cfDNA分析来源，但是血清比血浆中的cfDNA量高2-24倍。这主要是由于在凝血过程中受到细胞污染，因此很多实验室推荐使用血浆作为分析肿瘤特异性DNA的来源，原因是背景野生型DNA的浓度更低。虽然绝大多数研究表明癌症中cfDNA浓度较高，但是目前还不能评估患者循环中cfDNA的癌症特异性程度，因为cfDNA浓度增加也可以在生理学和非癌病理学情况下检测到。相比之下，在比较血浆和血清样品数据时，观察到健康个体和癌症患者存在明显的重叠。 较高浓度的cfDNA似乎仍然反映癌症患者的体内情况。在考虑将cfDNA浓度作为信息性诊断生物标志物之前，需要解决各种问题。第一，分析前程序需要标准化。有些研究涉及血液处理方法，包括接收样品和开始分离程序之间的间隔时间、离心条件和使用了血清还是血浆。选择确保提取足够多高质量DNA的分离方法很关键，结果表明血液采集和处理的分析前因素能够严重影响DNA含量。因为很多传统cfDNA分离方法费用昂贵、耗时长且复杂，Sonnenberg等人发明了新型电动学技术，能够直接从血液中快速分离cfDNA。第二，最重要的问题之一是定量方法缺乏一致性（harmonization）。不同的定量方法，包括分光光度法、荧光染料和定量PCR方法会产生差异结果，因为这些测量要么靶定总DNA要么只靶定扩增DNA。近来，Devonshire等人比较了7种不同参照基因试验的定量PCR测量。他们观察到与端粒相邻的位点比更接近着丝粒的位点丰富，证明了测量单一基因位点容易出现偏移（bias）。ctDNA定量尤其是这样，因为肿瘤发生各种拷贝数变化。其他方法则从血浆直接进行cfDNA定量，先前不做DNA分离。第三，对cfDNA释放的来源和详细机制所知甚少，而且大多数研究表明混淆事件也可能引起cfDNA释放，例如非恶性疾病、瘾君子、孕妇、锻炼和心功能不全，但却没有被纳入考虑。 因此，就可靠有效的cfDNA定量和分析方法达成共识至关重要，从而在临床上评估ctDNA作为液体切片是否能够获得可在不同实验室间相比较的更加一致的数据。 液体切片的临床使用 液体切片在临床中的应用是多方面的，因为使用血液的液体切片概念代表一种有用的工具，可以找出整个病程期间的肿瘤特异性变化（图3，表1）。液体切片可用于鉴别疾病复发以及疾病进展的替代指标，能够指出特定治疗是否适用或者是否能降低复发或进展的风险。
图4：健康个体和癌症患者的血浆DNA样品的大小分布 所有样品都显示了对应于核小体DNA的166bp片段富集，表明细胞凋亡是循环中DNA释放的主要原因。在患者亚组中也观察到更大的片段。 表1：液体切片的临床应用
cfDNA作为诊断生物标志物 临床上最早将cfDNA用作液体切片，是专注于简单地定量评估循环中的DNA浓度。有些研究报道表示从健康个体、良性疾病患者和癌症患者分离的血浆DNA数量存在显著差异。虽然一些研究揭示癌症患者的cfDNA浓度明显较高而且简单的cfDNA定量可以证实存在癌症或无疾病状态和治愈手术后的复发，但是许多其他研究也证明了只有cfDNA数量不是有用的诊断工具并且在不知道肿瘤突变的情况下cfDNA的效用受限。一项研究分析了CRC患者的总血浆DNA浓度和肿瘤特异性KRAS突变，结果表明数量更高的肿瘤特异性片段和数量更多的CTCs与血浆DNA片段的两阶段大小分布有关（图4）。然而，尽管处于肿瘤晚期，并不是所有患者的循环中都可以检测到ctDNA浓度。这一发现被Bettegowda等人近期的研究证实。Madhavan等人评估了一个较大乳腺癌患者群体（n=383）和一组健康对照（n=100）的cfDNA完整性。从健康对照到局限性疾病患者再到转移性乳腺癌患者，观察到cfDNA完整性分层降低和cfDNA浓度增加。另外一项研究表明所有被分析的CRC患者在手术时血浆和血清的cfDNA浓度都较高（定量方法），只有约37%的病例发生癌胚抗原值改变。 尽管简单的cfDNA定量可能对诊断和预后估计没用，但是监测肿瘤特异性变化可能是早期癌症检测和/或预后的有用工具。不过，肿瘤来源的循环DNA分数达到0.01%-≥90%范围，代表进一步的关键挑战。在某些临床情况下cfDNA浓度低于突变的最佳检测值。因此，将ctDNA用作诊断工具和用于检测最小残留疾病，需要高度特异性的标志物和分离灵敏度高的技术。 对于实体瘤采取的一个方法是检测复发体细胞重排，就像以前监测白血病的残留疾病负担。McBride等人绘制出了3名患者的基因组重排图，结果显示重排PCR试验可以检测到血浆中肿瘤基因组的单一拷贝且没有假阳性。应该注意到并不是肿瘤的所有重排都真实参与了肿瘤形成或进展，有些过客重排（passenger rearrangements）可能在复发克隆或转移时丢失了。最新报道的诊断方法有血液CRC筛查试验，使用SEPT9（septin 9）生物标志物特异性检测所有阶段和结肠直肠部位的大多数CRCs，或者使用血浆EBV DNA分析对没有临床怀疑的个体进行鼻咽癌早期检测。 ctDNA用作预后生物标志物 Lecomte等人的研究关注CRC患者的KRAS热点突变和周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）高度甲基化。他们证明了没有发现ctDNA的患者2年存活率是100%，这些患者具有KRAS突变或CDKN2A基因启动子高度甲基化，分别见于40%或20%-50%的CRC患者，表明了对这些标志物的预后价值。因此，血浆中存在ctDNA似乎是CRC患者的相关预后标志物，可用于鉴别高危复发患者（图2）。这些发现也被Diehl等人的研究证实，研究表明手术后可检测到ctDNA的患者一般在1年内复发。此外，结果显示高浓度cfDNA和突变KRAS是转移性CRC患者不良预后的明确指标。乳腺癌患者的研究报告了相似数据。不仅如此，近期研究表明在联合分析ctDNA和CTCs的肿瘤特异性突变时ctDNA似乎是比CTC更好的预后标志物。晚期非小细胞肺癌患者的研究获得了相似的结果，研究发现对于突变检测ctDNA分析比CTCs的灵敏度更高，而且检测到的突变与匹配肿瘤的突变状态有很高的一致性。 ctDNA用作预测生物标志物 液体切片最广泛和重要的应用之一是监测治疗效果，尤其是侧重于具有已知耐药机制的疗法。KRAS野生型结肠直肠瘤通常对EGFR阻断剂敏感，但是几乎所有患者会在数月内产生抗性。液体切片避免了重复治疗后肿瘤组织采样的障碍，而且可提供肿瘤病变内或各种肿瘤病变间的综合信息。 近期一项研究表明循环cfDNA能够更好地整体代表恶性疾病，是诊断DNA的可靠来源，可能代替肿瘤组织在诊断方面的应用。2012年Diaz等人检验了在接受帕尼单抗单一疗法的CRC患者的血液循环中是否能检测到突变KRAS DNA。治疗后5-6个月期间38%的患者血清中检测到KRAS突变。另一项研究分析了在应用靶向疗法之前的转移性CRC患者，结果显示对B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶（BRAF）V600E突变的诊断特异性和灵敏度均是100%，对7种被检测KRAS点突变的特异性和灵敏度分别是98%和92%。有趣的是，突变等位基因的数量在突变样品间高度变化（0.5%–64.1%，中值10.5%）。有些研究报道了对抗EGFR疗法产生抗性与获得性KRAS突变有关，发生新的局部扩增或高水平染色体12p多染色体，而且循环中的抗性克隆在临床进展明显之前数月可检测到。另外，近期证明了其他基因的局部扩增也与抗EGFR疗法获得性耐药有关，比如MET原癌基因受体络氨酸激酶（MET）和ERBB2。EGFR基因比例过高与良好的初始抗EGFR疗效有关。 方法学层面 一般来说，有两种血浆DNA分析方法（图3）。第一种是靶向方法，包括对原发肿瘤一小组常发驱动基因突变的已知遗传变化分析，比如KRAS或EGFR突变，这对治疗决策有意义。第二种是非靶向方法，不知道原发肿瘤的任何特异性变化。ctDNA基因组分析可用于在疾病监测、分子抗性检测和新治疗靶标鉴别的情况下发现肿瘤特异性变异。比全基因组测序成本效益更高的方法是外显子组测序，也不需要知道肿瘤的遗传图谱。 液体切片分析的靶向方法 cfDNA体细胞点突变的鉴别发表于1994年。至此以后，很多研究都分析了血浆和血清中的已知肿瘤特异性变化。随着技术进步，近年来检测的分析灵敏度大幅升高，新技术包括ARMS（扩增受阻突变系统）、数字PCR（dPCR）和微珠-乳剂-扩增-磁学（BEAMing）能够鉴别特低频的突变等位基因。Newman等人介绍了癌症个体化深度测序分析方法（CAPP-Seq），使用这种方法对ctDNA定量既经济又超灵敏。该方法结合了最佳化低输入DNA文库制备方法与多阶段（多相）生物信息方法，设计了一种“选择器”，包含靶定癌症循环突变域的生物素化寡核苷酸。在所有II–IV期和50%I期的非小细胞肺癌患者中检测到ctDNA，诊断特异性从突变等位基因片段的96%下降到预定突变的约0.02%。ctDNA浓度与肿瘤体积高度相关，能够区分残留疾病与治疗相关影像学变化。另外，ctDNA浓度测量比放射方法能更快评估疗效。Bettesgowda等人最新的研究分析了具有不同肿瘤疾病和肿瘤分期的一个大癌症患者群体。ctDNA对于检测临床相关KRAS基因突变的诊断灵敏度是87.2%，特异性99.2%。但是，他们使用了高度灵敏的分析方法包括dPCR和安全测序系统（Safe-SeqS）方法。Safe-SeqS是同一个研究小组先前建立的，能够有效检测极低水平的肿瘤特异性突变，通过使假定测序误差降低至少70倍与背景信号进行明确区分。Bettesgowda等人的研究表明Safe-SeqS能够检测出5mL血浆的一个DNA突变模板。此外，作者筛查了高度肿瘤特异性易位，可用于检测极低水平的肿瘤特异性变化以鉴别最小的残留疾病。 虽然如此，大多数这些方法只靶定少数位点，而错过了缺少突变热点的基因突变比如肿瘤抑制基因。将没有热点的驱动基因包含在内的一个可能是选定基因（已知与肿瘤形成和进展有关）的靶定测序。我们的一项研究在常见于易位的染色体区域定向富集后直接从血浆中成功鉴别出结构性重排。超过4000例肿瘤样品的综合分析，包括来自癌症基因组图谱（TCGA）和独立的、非TCGA群体的3600多个数据集，显示10个肿瘤疾病的全发生率是76%，一组25个选定基因中至少有一个突变可以被鉴别出来。然而，相当大基因组区域或较少毫微克cfDNA片段模板的低频等位基因突变的鉴别更有挑战性。为了捕获血浆中的肿瘤特异性突变，Forshew等人建立了所谓的标记扩增子深度测序（TAm-Seq），包括5995个低频突变基因组库。使用这种方法，研究者鉴别出等位基因频率低至2%的癌症特异性突变，诊断灵敏度和特异性均>97%。较小的已知突变筛查能达到约0.2%的检测限。 液体切片分析的非靶向方法 液体切片基因组分析的主要优势在于这种方法适用于所有患者，因为它不依赖于复发遗传变化。虽然我们的研究表明可以用微阵列比较基因组杂交（array-CGH）分析血浆的基因组拷贝数，但是NGS方法能够增加cfDNA拷贝数分析的分辨率（resolution）。Dennis Lo研究小组是第一个建立血浆基因组分析的，他们进一步发明了这种技术，综合评估低甲基化和癌症相关拷贝数变异。作者表示肿瘤相关拷贝数变化（CNAs）也可以通过亚硫酸盐DNA测序数据确定，可用于检测非转移性癌症病例。血浆低甲基化的诊断灵敏度和特异性分别为74%和94%。测序深度降低到1千万序列（reads）对灵敏度和特异性没有不良影响。我们的研究小组证明台式MiSeq测序平台（Illumina）生成的4百万序列即能可靠检测到CNAs。Leary等人建立了一种全基因组测序方法，称之为重排末端个体化分析（PARE），以鉴别实体瘤易位并将这种方法应用到血浆DNA样品，通过这种方法他们鉴别出一些染色体拷贝数变化和重排，包括癌症驱动基因扩增比如ERBB2和周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）。因为大多数癌症包含不太可能存在于正常细胞的多重染色体变异，这是一种高度特异性方法。但是，相似地，Thierry等人研究了范围在0.5%-64.1%的突变等位基因，该研究中循环肿瘤DNA的浓度变化巨大，从1.4%到47.9%。Murtaza等人对血浆DNA样品进行了外显子组测序并关注了多个疗程。对血浆中等位基因分数定量鉴别出与疗法抗性相关的突变等位基因增加。作者总结道，循环肿瘤DNA的外显子组分析是对当前侵入性活检方法的补充，以鉴别与晚期癌症获得性耐药相关的突变。 Dawson等人近期报道了，使用全基因组测序与个体化试验相结合来量化连续收集的转移性乳腺癌血浆样品的循环肿瘤DNA。在用全基因组测序确定患者特异性突变后，将这些突变用于评估连续样品的ctDNA浓度。研究者发现与CA15-3（糖类抗原）或循环肿瘤细胞相比，突变ctDNA浓度呈现更广的动态范围和与肿瘤负荷变化的更大相关性。与其他研究相似，这种方法的主要局限性在于需要提前知道变异 – 不管是结构性的还是核苷酸水平的 – 来设计一个个体化试验。另一个研究小组利用Affymetrix SNP 6.0阵列分析65例乳腺癌患者的CNAs和杂合性丢失（LOH）。他们发现配对肿瘤存在局部高水平DNA扩增而且cfDNA在很多染色体臂聚集成群，其中一些包含具有致癌可能的基因。引人注目的是，在50名患者的随访样品中，原发肿瘤已经存在的特异性CNAs在cfDNA中检测到，但是在诊断后12年都没有其他疾病证据。这表明非侵入性方法可用于随访期间检测患者的蛰伏/最小残留疾病。
基因组方法的缺点之一是缺乏分析灵敏度，虽然已经尽很大努力降低MPS误差率来改善检测限（经过近期提出的双重法例证），但是这些方法均尚未用于综合分析血浆的肿瘤基因组（图3）。尽管如此，仍有很多非侵入性方法可以分析肿瘤，只是不知道哪个方法是最好的。拷贝数分析低覆盖测序方法一方面能够快速提供临床相关信息且成本效益高；另一方面，这些方法缺乏分析灵敏度，不能检测核苷酸水平的突变。但是，目前增加深度仍然意味着增加成本和时间，这对于实际临床操作是种阻碍。考虑到最近测序成本从2009年108.065 USD每基因组降低到2014年4.920 USD[这些数字包含人力、行政、管理、设施、试剂和耗材（http://www./sequencingcosts/）]和速度提升，适当深度cfDNA的全基因组测序最终将用于临床目的。此外，更新的测序技术比如纳米孔测序开始出现，可在不需要扩增的条件下增加准确度和可靠性，从而通过排除主要偏移来源提高灵敏度。 液体切片的临床应用 迄今为止，临床试验执行ctDNA分析的大型可控研究很少。一项包含105名实体瘤患者的研究证明了，在重复肿瘤活检并不安全可行且档案肿瘤基因组分析不充分时液体切片对晚期癌症患者有益；研究中的患者被推荐参与I期分子靶向药物试验，用Sequenom MassArray System 和 OncoCarta组合分析体细胞突变。Schwarzenbach等人执行了一项多中心研究，招募了388名没有进行化疗的原发乳腺癌患者并调查了8个基因的LOH。另一项研究包含108名转移性CRC患者，监测基准以及每个三线治疗周期（西妥昔单抗和伊立替康）之前血浆中突变KRAS/BRAF等位基因的丰度。cfDNA和 KRAS浓度从基准到第3周期降低，在疾病进展时增加，突变丢失与疗效受益有关，而治疗期间出现突变可能是因为原发野生型疾病获得性耐药。同一小组研究了二线化疗期间CRC患者的总cfDNA和健康对照以及具有不同并存病的患者的cfDNA。cfDNA浓度在CRC患者中比在对照中明显更高，同样使用伊立替康的情况下高浓度患者的存活期比低浓度患者短。另外，标志物分析与血浆KRAS突变相结合进一步增加了预后影响。 大家清楚认识到液体切片在临床癌症研究领域的应用，现在有些临床试验的设计通常包括液体切片。但是，关于液体切片在临床实践中的实际实施，有必要建立标准化的分析前和分析方法，包括血液采集、处理和储存以及DNA提取、定量和大型前瞻性临床研究的确认。只有在可控研究的过程中物流采样（logistical sampling）才得以促进，从而提供统计学上强有力的样品量包括治疗前和随访样品。只有在用充分样品量执行长期研究而且研究结果与无疾病存活率/总存活率和其他临床背景相关时，才能取得临床应用的进展。此外，因为ctDNA的释放动力学没有被完全阐明，所以与治疗相关的ctDNA分析时机很重要，应该在不同时间点从相同患者获得多份样品。例如，服药后不久和服药期间监测ctDNA可能获得不同的ctDNA等位基因分数，提供有价值的ctDNA释放动力学信息。 未来展望 许多数据表明ctDNA分析对于癌症患者的诊断、预后和管理是一种补充工具；因此，ctDNA可用作非侵入性的癌症生物标志物。虽然一般来说生物标志物发现是一个不断发展的领域，但是很多肿瘤疾病缺乏周期性遗传变化，突出了对发现特异性癌症特征和提高基因组分析的分析和诊断灵敏度的需求。此外，需要更多地关注肿瘤内异质性的复杂性。尚不清楚ctDNA是否代表不同部位的所有相关转移性细胞克隆，是否代表促进临床进展和/或治疗抗性的不同亚克隆DNA。所以，需要进一步临床评估、血浆DNA的比较序列分析、以及活检与影像学研究和详细功能研究相结合，来详细评估临床进展和/或治疗抗性。近期研究表明我们显然不能假设肿瘤内异质性只基于遗传变化；所以，表观遗传变化也必须考虑，从而增加了另一个水平的复杂性。一般来说，表观遗传变化被认为是癌症形成的早期事件，因此可能是早期检测的适合标志物。不仅如此，非侵入性地确定表观遗传靶标成为癌症化疗以及化学预防的有效、有价值方法。 总之，虽然为了开发适当工具全面分析血浆DNA肿瘤基因组做出了所有努力，目前大多数实验室过程在诊断环境下实际实施太费时费钱。但是，测序成本将进一步下降，而且该领域的技术也在不断进步。因此，随着技术进步和成本下降，实验室（检验）医学常规使用高分辨率的基因组方法只是时间问题。而且，循环中突变片段的丰度的极大变异性会影响方法学的分析灵敏度。在肿瘤特异性DNA数量对于当前可用技术而言太低的情况下，例如早期阶段或最小残留疾病，这尤其是决定性因素。取决于放大灵敏度的所有当前可用NGS方法，由于DNA聚合酶误差率（一般是0.01%）受到限制。但是，第三代测序方法的出现将使PCR扩增和移相带来的偏移相关问题最小化。 不考虑技术局限，需要进一步发展来建立临床标准，在精心设计和充分权威的多中心研究中确认液体切片作为临床生物标志物的效用。 （摘自Clinical Chemistry，版权归其所有，仅供内部学习） 编译：王小茜 |
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