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干货 | PCR引物设计,3款在线软件就能搞定!

2017-07-29  zhongguor...



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作者:解螺旋·子非鱼

如需转载请注明来源:解螺旋·医生科研助手


·导语·

好的引物会让PCR实验成功一半,因而,引物设计一直都是PCR非常重要的环节。PrimerPremier5和Oligo7这两款软件想必是备受科研汪们推崇的引物设计软件。可是对于懒癌晚期的小鱼而言,下载这两款软件也是一件非常麻烦的事情。有木有比这两款软件更简单粗暴的引物获取方法呢?在这里小鱼特地给大家推荐3款简单实用的在线PCR引物设计软件,让你分分钟搞定PCR引物。

No.1 :NCBI的Primer-Blast

推荐指数:五颗星

理由:这个工具整合了目前流行的Primer3软件,且加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证;可以针对某一特定剪接变异体基因来设计引物。

网址链接:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/或者直接从Blast主页(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到。

 

Primer-Blast的界面包括4个部分:PCRTemplate(模板区),Primer Parameters(引物区),Exon/intron Selection(外显子内含子设置)和specificity check(特异性验证区)。


1、设计引物




2、验证引物好坏




3、外显子内含子(Exon/intron)


如果设计的引物是跨内含子和外显子的交界处,可在此处设置成为Primer must span an exon-exon junction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。




4、特异性(Specificitycheck)


在specificity check区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。



 

这里提供了7种数据库:


RefSeq mRNA,Genome (referenceassemblies from selected organisms),RefSeqrepresentative genomes,RefSeq RNA(refseq_rna),nr (the standard non-redundant database),Genome (chromosomesfrom all organisms)和custom。


前两个数据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。特别是,当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。


最后建议用oligo6或primer5验证引物自身的特性:发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体,△G的绝对值。

No.2 :Primer3 Plus

推荐指数:五颗星

理由:严格的qPCR引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子,最好在3‘端设计引物,产物的长度在300bp以内等。本在线软件可满足qPCR引物设计的要求。

网址链接:http://www.primer3plus.com/




1、选择Run latest Versionof Primer3Plus,就进入了设计引物的主页面,合理的使用<>,[],{}符号使引物设计符合自己的要求,大家可以在具体实战中,深入体会这几个符号带来的方便。





2、避免多个重复碱基出现,避免4个或超过4个G出现在引物序列中。按照荧光定量引物要求设置参数,如产物长度:不应该超过400bp,最好100-150bp;GC%:30%-70%,最好45%-55%;引物长度:18-25bp,最好22-24bp;TM值:58-60℃,最好60℃;3’端:3’端至少4个碱基保守,最好为T,C,G。




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