【原】实验新人必读（七）：一文学会读懂和查找质粒图谱

作者：解螺旋.子非鱼

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导语

质粒图谱即为质粒DNA序列的物理图谱，包含了质粒大小、筛选标记、克隆位点、转录及翻译元件等信息。尽管它为我们选择质粒、了解质粒特点及应用提供了重要依据，然而我们常常要为图谱中丰富信息所困扰。那么，本文就为你拨云见日，让你快速掌握质粒图谱。

三步法看懂质粒图谱

Step 1:先了解质粒的基本组成元素。

1）复制起始点Ori。该位点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数，它是质粒中一段特定序列，富含AT和重复序列。

 

Tips：图谱上只有一个Ori，表示质粒是原核克隆表达质粒；有两个Ori，则表示该质粒是，穿梭质粒，即可在原核也可在真核中复制。

 

2）抗性筛选基因。图谱中Kan/tet就是抗生素抗性基因，方便后续通过抗生素筛选阳性克隆。特点就是单词最后会以大写R或上标r结束。

 

Tips：一般克隆载体只有一种抗性筛选标记，部分表达载体及穿梭质粒具有两种抗性筛选标记。

 

3）多克隆位点（MCS），即一系列限制性内切酶酶切位点，是外源DNA插入位点，一般可通过酶切/连接方式将外源DNA插入质粒，外源DNA一般小于10kb，而片段越长，转化效率越低。

 

Tips: 一般位于转录启动和转录终止信号之间；所包含的限制性内切酶位点数量和组成因载体不同会有所差异，且其中的酶切位点在质粒中为单一的酶切位点；同时在使用时需注意质粒载体与外源DNA酶切位点的兼容性问题

 

4）荧光标记或蛋白标签序列。蛋白纯化标签蛋白：His-Tag，GST-Tag等；蛋白检测标签蛋白：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Tag等；荧光蛋白表达标签：GFP，mCherry等。

 

Step 2:看质粒是否是表达载体，如果是，那就必定有这些原件：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。

1、启动子：促进DNA转录的DNA序列，可与RNApol特异性结合。

 

2、增强子/沉默子：前者是真核基因组中一种增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作用与增强子所在位置或方向无关。后者是负增强子，负调控序列。

 

3、核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。

 

4、转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA 的保守序列，此位点 down-stream 有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成 poly（A）加尾信号。

 

Step 3:弄清楚方向，即为何质粒图谱上有的箭头顺时针而有的箭头逆时针。

其实那是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的某些基因在另一条链上。当然，最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段（从T7启动子到终止子那一段）的方向，即下图黄色圈圈所示的箭头方向，其它的大可以忽略。

如何查找质粒图谱

方法一：Vector NT软件

回复vector，即可下载软件及其使用说明。

毋庸置疑，这款软件绝对是了解质粒图谱的一个压箱底的法宝，它包含Invitrogen公司里所有的质粒图谱信息和其他比较常见和经典的质粒图谱，可使得初接触分子克隆的小伙伴们对质粒图谱有着简单直观的认识，真正做到了软件在手，质粒我懂。

 

方法二：查找质粒图谱的网址

 

1.Vector Database

网址：http://www./vector-database/

 

直接再输入框中输入pET，即可搜索出相关质粒。

而后点击自己所需要的质粒名称，就可以看到质粒的详细信息以及图谱。

 

2.Vector DB

网址：http://genome-www./vectordb/vector.html

 

该网址里对质粒的总结和分类比较完整，基本囊括了所有表达系统的质粒信息。不过，让人有些不爽的是这个网站竟然没有搜索栏，太不人性化了。好在小鱼有妙招：按Ctrl + F，输入质粒名称即可。

点击所需质粒名称即出现以下界面，此时点击sequence link可查看该质粒的序列，而点击NCBI link，就可以直接跳转NCBI页面。然后点击右边的send to，选中File，GeneBank等选项，点击Create File选项可得到一个gb格式文件，导入vector软件中，即可得到质粒图谱。

 

3.Google学术

网址：https://www./

 

在搜索框中输入质粒名称+map，或者质粒名+sequence+filetype:txt/filetype:pdf，又或者进入Google后，点击图片搜索，直接查找图谱。

 

4.悠游博客

网址：http://yoou./5757561.html

 

如果你能在该网址里找到自己所需的质粒，点击相应的质粒名即可查看质粒图谱。

 

方法三：公司试剂网页

 

有些商业化公司整理某一系列的质粒相关信息，如克隆载体pMD18-T，TaKaRa；pGM-T，天根；表达载体Novagen公司的pET系列等。因而如果知道常见的质粒是哪个公司的，去其官方网站上可以查找该质粒的相关信息。

 

方法四：寻找改造后的质粒图谱

 

有些经过改造的质粒可先将名称输入Google scholar中，查看使用过该质粒的文章，进而了解该质粒的来源，因而向文章作者进行咨询。以文章Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). "Site-specific chromosomalintegration of large synthetic constructs." Nucleic Acids Res38(6): e92为例，也可先在PubMed中进行搜索，而后在Related Information中点击Nucleotide，并按照在NCBI下载质粒图谱的方法获取质粒图谱即可。

质粒图谱的绘制

Winplas2.7作为质粒绘图的专业软件，文件很小，最主要是简单易学，可在知道或不知道序列的情况下绘制质粒图。接下来，就简单介绍下“白手起家”（不知道序列情况下）时这款软件的使用方法。

回复winplas，可获取软件

1、点击“文件”菜单中新建命令，出现MapView窗口，同时工具栏中地绘图命令显亮。

2、点击“插入-空片断”命令，出现一个“创建新质粒”对话框。，在“标题栏”中填入质粒名称,在“碱基对”栏中填入质粒大小,在“类型”单选框中设制质粒图谱为线型还是环形。

3、点击“确定”后，在Map View窗口就会出现一个圆环，其中有质粒名称及质粒大小。

4、点击“插入”菜单中“区域”命令，弹出“Edit Arc Object”对话框。

*在Arc书签中的“碱基对”栏中，填入Arc的起始位置，如209。

*在“长度”栏中填入Arc的长度，如654。在标签栏中填入Arc的名称，如pCMV。

*在Arc Style书签中，首先确定该Arc是否有箭头以及箭头的方向。分别对应none, 5’→3’,3’→5’,及双向。

*通过Width来确定Arc的宽度，也可以调节箭头与Arc径宽度的比值。

*改变填充样式以区分不同的Arc;改变Arc的颜色;同样也可以改变字体的样式、颜色等。

点击OK，则在图谱中209-863bp位置出现一个Arc，名称叫pCMV。

 

5. 对于任何一个项目，如需要修改，我们只需用鼠标左键选中它（哪里要修点哪里！），并双击，即可出现相应的编辑窗口。对于文字及质粒名称、大小，我们可以用鼠标在任意位置拖放。其它的修饰，点击Edit菜单中“质粒选项”命令, 可以调节质粒环的粗细、大小（半径）环的颜色以及背景颜色；标记连线的粗细、颜色以及标出Marker的位置；以及Arc名称连线的粗细、颜色、Arc边缘的颜色等。如此下来，一个质粒图谱就妥妥的出炉啦。

PS：在知道序列结构时绘制质粒图：只需要选择File New后，在“插入”菜单选择“GenBank文件”或者“序列文件”，选择一个指定文件，确定后，便根据此序列生成质粒图，进行进一步编辑。当然，在知道序列结构时绘制质粒图时也是可以自己一步步画出来哦（不建议懒癌晚期的人群使用！）

附录：常见质粒图谱清单