评书：CRISPR-潘多拉的盒子

前文再续,书接上一回

话说近日，本白讲过多期CRISPR，听众留言小白：何为？且听本白娓娓道来~~

    历史长河滚滚， 浪花淘尽英雄， 笑谈古往，多少刀光剑影；然，乱势造英雄，在这群雄逐鹿的生物界乃至整个科研界，一颗新星正冉冉升起，且把功名留后人......

（此处三弦奏乐，观众席叫好）

且说...

CRISPR技术的出现改变了这个学科，也让生物学家们以前所未有的方式操纵细胞。一系列的研究揭示出了细菌这一免疫系统的运作方式，并很快挖出名为Cas9蛋白的幕后黑手，疯狂的科学家们很快发现了Cas9蛋白编辑基因组的潜在能力。。

时光追溯，回到上世纪八十年代，农历丁卯年1987年；

科学家们首次在大肠杆菌中发现了CRISPR基因，并在随后的40%的细菌中和90%的古细菌体内发现了类似序列。

该序列特点是被独特的剪切序列所间隔的短重复序列， CRISPRs序列与CRISPR相关基因(cas)在基因组上位置非常靠近

直到本世纪初期农历农历乙酉年2005年；

CRISPR序列才与抗噬菌体的免疫作用联系起来。

新世界大门就此打开，任督二脉正式打通。

  整个CRISPR-Cas9获得性免疫系统通路，经过一系列研究试验，最终盖棺定论，大致分为三个步骤：获得CRISPR序列-产生CRISPR RNA-干扰目标DNA片段。

在获得阶段

从外源性DNA获得新的间隔片段，并插入到CRISPR基因座的末端；

产生阶段

RNA前体从CRISPR基因座上转录出来并加工成成熟的crRNAs(CRISPR-RNAs)；

干扰阶段

CRISPR-RNAs被一个或多个Cas9蛋白结合，形成核糖核蛋白靶向复合物。最终，Cas蛋白会把与crRNA互补的序列切割降解。

CRISPR-Cas9获得性免疫系统通路             （图源自www.cell.com）

）

CRISPR-Cas免疫系统又被分为三种不同类型，又根据cas基因的发展史，分为数目可观的亚型，尽管在许多地方相当的保守，但也存在显著的不同之处。

   

    例如，Ⅰ型和Ⅲ型的系统仅仅需要crRNA进行序列引导，然而，Ⅱ型系统会用到反式激活的crRNA(tracrRNA)。除此之外，crRNA-Cas蛋白复合体中蛋白组成也是高度可变的，Ⅰ型和Ⅲ型的系统通常会有超过8个亚基组成蛋白复合体，Ⅱ型系统仅仅需要一个多肽(Cas9)就能工作,而我们平时用的就是这些。

花开两朵,各表一枝，这边概述完CRISPR-Cas9，再说另一边--它的多功能了

由RNA引导的Cas9靶向DNA

    Cas9是一个DNA限制性内切酶，能够在与引导RNA互补的DNA上产生双链切口(DSBs)。理所当然，Cas9蛋白的功能也取决于引导RNA。

引导RNA由crRNA和tracrRNA两部分组成，crRNA的5’末端与目标DNA互补，而在3’末端与tracrRNA形成双链促进Cas9蛋白的募集。

    高效的靶向作用还需要目标DNA序列近侧存在一个短结构域，被称为是前间区序列邻近基序(PAM)。DNA序列上存在PAM结构就会被剪切，而CRISPR自身基因座上的序列，同样也能被引导RNA识别并结合，但因为不存在PAM结构，所以不会被Cas9蛋白切割。

CRISPR-Cas9基因编辑系统

    简单概括CRISPR-Cas9技术，就是sgRNA引导序列设计为在目的序列NGG结构的上游20个碱基的互补序列。同时将Cas9蛋白和sgRNA用慢病毒或者质粒进行转染、或者直接注射DNA/RNA，甚至直接转染蛋白复合体等。Cas9蛋白就能靶向感兴趣的基因座，并产生双链切口(DSBs)，然后切口会被细胞本身的修复机制所修复。

01

第一栏

    非同源末端连接修复(NHEJ)就是其中一种，而NHEJ是一种易错修复途径，通常会引起少量插入或者缺失突变，开放阅读框(ORF)就会被破坏，这个基因就被灭活了。

02

第二栏

    同源重组修复(HDR)，通过在Cas9-sgRNA组分中加入一个供体DNA，供体DNA上带有靶向位点侧翼的同源序列，DSBs的修复会以供体DNA为模板进行。

笔记

PAGE1

这项技术允许我们在感兴趣的基因里添加新的序列，比如抗原表位标签，还能特异性的产生定向突变，比如对引起疾病的基因进行修复或者模仿。

然而，HDR的效率是远低于NHEJ的，需要进行更多的改进和探索来提高它的效率。各国科学家也想出许多令人目瞪口呆的黑科技，来提高NHEJ或HDR的效率。

CRISPR-Cas9：一个多才多艺的DNA结合系统

Cas9蛋白产生的DNA双链断裂(DSBs)，是由两个蛋白结构域来实现的(HNH和RuvC)，通过点突变使这两个结构域失活，就能得到一个保留了靶向DNA结合能力而无催化活性的Cas9蛋白(dCas9)。

(图源自维基)

当dCas9与sgRNA在细菌中共表达，它们能结合在启动子上把RNA聚合酶挤开，从而使特定转录本表达量下降。而通过在Cas9上嵌合一些特定的效应分子，也许可以开发出更稳定高效的真核生物基因表达调控系统，比如转录阻遏子和激活子，通过sgRNA的引导到达相应的基因座。

而通过在Cas9上嵌合一些特定的效应分子，也许可以开发出更稳定高效的真核生物基因表达调控系统，比如转录阻遏子和激活子，通过sgRNA的引导到达相应的基因座。

笔记

PAGE2

在dCas9上融合GFP蛋白，就可以在活细胞中观察到相应的DNA座位，为基因组的形态观察及动力学研究提供一种独特的方式。

    dCas9与表观遗传效应分子的融合，使这个系统能够特异性干扰表观遗传修饰。

新近的研究还报道了dCas9系统还可以以单链RNA为靶点，对细胞中RNA转录子的操作也将成为可能.

CRISPR-Cas9系统的脱靶效应

   许多基因工程技术的成功，不论是作为一个研究工具还是临床应用上，都会收到其特异性的限制， CRISPR-Cas9系统也不例外。

sgRNA的20个碱基的序列特异性会显著影响系统的特异性，尤其是靠近PAM序列的错配，发生错配将最大程度的影响系统的切割效率。

为了应对CRISPR-Cas9系统的脱靶效应，科学家们搞了许多黑科技。

    首先，一种Cas9蛋白的切口酶变体，使用一对sgRNA引导Cas9蛋白在目的DNA临近的两个位置上形成切口，模拟双链切割。

而单个sgRNA引起了脱靶切割，只会引起双链DNA的单链断裂，修复DNA单链断裂不会引起插入或缺失突变。大幅度降低了脱靶效应。(图片来自www.genecopoeia.com)

其次，将dCas9蛋白与FokI进行融合，一对sgRNA引导dCas9-FokI到临近的两个靶点上，当FokI蛋白形成二聚体时，Cas9蛋白才会产生DSB，而FokI单体存在时，dCas9-FokI不具有切割活性。(图片来自www.genengnews.com)

笔记

PAGE3

最后，在不牺牲特异性的条件下，使用更短的sgRNA会降低脱靶效应，而且不会影响到系统的编辑效率。

本堂讲解为概论，如欲知详情，且听下回分解