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沙师弟进实验室已经有蛮久了，质粒抽提啥的也都能非常熟练操作了。小林子有时候爱偷懒，就偷偷让沙师弟帮他抽提一些组织样本的DNA。可是每次小林子第二天来的时候，都发现沙师弟抽提质量堪忧，就没咋抽提出DNA来。 实在是没啥办法，就只能带着沙师弟去找莫愁了。莫愁先数落了一顿小林子，为啥自己的实验要让师弟去做呢。再就问了一下沙师弟，到底是用啥方法抽提的DNA呢？ 沙师弟：师姐，这个我是和质粒抽提一样做的啊，这样不行么…… 小林子：………… 莫愁：小沙啊，基因组DNA的抽提，一般不会用到质粒抽提的……两者虽然都是DNA抽提，但其实在实验原理上都不太一样，其实关键在于这两者在实验的初始设计上就完全不同。先给你解释一下质粒抽提吧。 质粒抽提通常用的是碱裂解法，一般的试剂盒都会有Solution I，Solution II，SolutionIII，有的还会有SolutionIV，然后是过柱子。 拆开来讲，Solution I一般都是用来重悬菌液的，会加入RNase I，降解掉里面大肠杆菌的RNA。同时里面还会用Tris-HCl体系来维持一个pH，另外会加入较大量的EDTA，去螯合掉里面二价金属离子，使菌体本身的DNase失活。其实用双蒸水来代替Solution I问题也不大，关键就是把菌重悬起来就行。 实验万事屋作品 然后是Solution II，一般来说主要成分有两个，就是NaOH和SDS，NaOH主要是用于破坏细胞膜结构，强碱条件下，菌体的细胞壁结构、细胞的磷脂双分子层和微囊结构的构相都会发生变化。而SDS在这里主要并不是起到裂解蛋白的作用，而是结合氨基酸，一般两个氨基酸可以结合一个SDS分子。菌体裂解后，其实小片段的质粒已经释放出来了，而大片段的基因组DNA还结合在蛋白质上。 结下来是Solution III，这都是一环扣一环的，SolutionIII的主要成分是醋酸钾/醋酸缓冲液。首先长时间强碱环境下，DNA会断裂，所以需要用醋酸进行中和，而钾离子可以与SDS产生沉淀反应，使可溶于水的十二烷基磺酸钠变成不溶于水的十二烷基磺酸钾。这样结合蛋白质的PDS就被沉淀下来了，同样基因组DNA也同样被沉淀了下来，用硅胶吸附释放在上清里的质粒，或者用无水乙醇对上清进行沉淀，即可获得质粒的DNA。 实验万事屋作品 普通的基因组DNA抽提，首先是裂解，用离子型的蛋白变性剂：CTAB或者SDS对细胞进行裂解（加不加蛋白酶K其实并不太要紧），破膜的同时使得DNA从蛋白上解离下来。加入高盐溶液使蛋白质沉淀。然后用酚仿，使蛋白质沉淀变性在水相油相间，并分离出的可溶性蛋白。上清用异丙醇将DNA沉淀下来，同时低温加入一定量的一价阳离子，可加速DNA沉淀。 好了，小林子，这样你就能明白为啥基因组DNA不能用质粒抽提的试剂了吧…… 小林子：……师姐……不是我问你的……
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李莫愁博士：有很多师弟师妹们都会抽提DNA，但DNA抽提的具体原理其实并不清楚。看了今天的帖子，大家明白了么，再简单的实验也有着极为精细的实验设计在里面。大家如果只是按照Protocol来做实验，最终一旦出现了问题，也无从解决，要么是怪试剂盒不对，要么觉得自己手气不好。其实有时候，实验的问题就往往出现在细节上。比如今天介绍的DNA抽提，在各个Solution中，所有的成分都有着他的用武之地，环环紧扣。所以，仔细了解每一个步骤的原理，也就能分析出实验失败的原因了。不光是DNA抽提，所有的实验其实都一样哦！ 好了，今天就策到这里了…… |
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