羊乳酪蛋白的乳化性质和热稳定性研究

GXF360 2017-08-02

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1. 齐鲁工业大学轻工学部食品科学与工程学院（济南 250353）；2. 山东农业大学动物科技学院（泰安 271018）

摘要：试验采用等电点沉淀法和高速离心法提取崂山奶山羊原料乳的酪蛋白, 并对其等电点、SDS-PAGE图谱、乳化活力、乳化稳定性、浊度和热稳定性进行分析。结果表明: 崂山奶山羊乳酪蛋白的等电点pH为4.10, 分子量为20~40 kDa, 包括α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋, 且β-酪蛋白含量最多。两种提取方法所得酪蛋白溶液的乳化性质和浊度具有极显著性差异 ( p＜0.01); 酪蛋白的热稳定性随温度的升高而降低。相比于高速离心法, 等电点沉淀法制备的酪蛋白电泳图谱条带清晰、纯度较高、热稳定性较好, 且酪蛋白溶液的乳化性均一性好。

关键词：羊乳; 酪蛋白; 等电点沉淀; SDS-PAGE电泳法; 乳化性质; 热稳定性

山羊乳平均含蛋白质3.5%[1]，其中，酪蛋白约占羊乳总蛋白质的70%，通常以聚集体的形式存在，且生物学价值高达85%[2]。乳酪蛋白作为一种具有结构柔性和热稳定性的蛋白质，已作为一种食品添加剂被广泛应用到食品工业中。人们食用乳制品中的酪蛋白均是以全酪蛋白的形式存在，故相比于对单一酪蛋白组分的研究，对全酪蛋白的研究更具有实用价值和意义[3]。

热处理是影响乳品质的一个重要过程，其热稳定性和乳化性质直接决定着羊乳蛋白质品质的高低[4]。酪蛋白的稳定性主要指酪蛋白胶体的稳定性，由酪蛋白的胶束结构决定[5]。外界因素诸如温度、pH、盐离子或其他处理固然会影响到酪蛋白的乳化性质和稳定性[6-8]，但不同的提取方法对酪蛋白产生的影响也至关重要，选择制备步骤简便、提取纯度高的酪蛋白的提取方法是进一步研究酪蛋白胶束结构、功能性质、胶体稳定性以及热稳定性的关键。试验采用等电点沉淀法和高速离心法制备羊乳酪蛋白，并对其十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳图谱（SDS-PAGE）、乳化指标、浊度以及热稳定性进行分析，探讨了不同提取方法所得酪蛋白的乳化性质和热稳定性，以期为后续探讨羊乳营养品质的高低以及羊乳的稳定性提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

试验用羊乳取自泰安市三喜奶山羊养殖场的崂山奶山羊生鲜乳，机器挤奶，取样后于冰盒中带回，并于-20 ℃冰箱冷冻储存；试验中所用试剂均为分析纯。

TGL-18M冷冻离心机：济南龙瑞商贸有限公司；STRATOS离心机：美国Thermo公司；Free-Zone2.5L复叠型冷冻干燥机：美国Labconco有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SDT-Q600型DSC/TGA同步热分析仪：美国TA仪器厂；DYY-2C型电泳仪：北京市六一仪器厂；等。

1.2 提取方法与样品制备

1.2.1 乳脂分离

取冷冻鲜羊乳，室温下解冻，双层纱布过滤，4℃，5 500 r/min，离心15 min，弃去上层脂肪，并将底部少量的酪蛋白沉淀混匀，再用双层纱布过滤，进一步除去少量脂肪及杂质，得脱脂乳，于4 ℃条件下冷藏备用。

1.2.2 酪蛋白的提取

高速离心法：将脱脂乳在20 ℃，26 916 g，离心1 h，倒掉上清液并量取体积，下层沉淀即为酪蛋白沉淀[9]。

等电点沉淀法：将脱脂乳调节pH至酪蛋白等电点，4 000 r/min，离心15 min，倒掉上清液并量取体积，下层沉淀即为酪蛋白沉淀。

1.2.3 酪蛋白的提纯

高速离心法：将酪蛋白沉淀表面用蒸馏水洗涤3次，然后加入与上清液体积相等的蒸馏水并搅拌均匀，倒在培养皿中，用保鲜封口，放于-20 ℃冰箱中过夜，然后进行真空冷冻干燥，得纯品酪蛋白，记为样品A。

等电点沉淀法：将酪蛋白沉淀表面用蒸馏水洗涤3次，分别加入与上清液体积相等的蒸馏水洗涤三次、95%乙醇洗涤一次、乙醇-乙醚（等体积）混合液洗涤两次，每次洗涤均4 000 r/min，离心10 min，最后加入等体积的无水乙醚，抽滤，然后用40目标准样筛过筛，放于37 ℃烘箱中烘干，得纯品酪蛋白[10]，记为样品B。

1.2.4 酪蛋白溶液的制备

将酪蛋白分别溶于pH 7.0，0.1 mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，涡旋1～2 min，4 000 r/ min，离心5 min，配成浓度为25 g/L[11]的溶液，于4 ℃条件下冷藏，用于后续乳化性质以及浊度的测定。

1.2.5 SDS-PAGE的样品处理[12]

一是直接取1 mg酪蛋白纯品，二是酪蛋白纯品用0.1 mol/L NaOH溶液配成浓度6 mg/mL取1 mL，分别与等体积蛋白样品溶解液混合均匀。然后取部分沸水浴加热3～5 min，取10 μL加样。鉴于采用等电点沉淀法得到的酪蛋白pH偏离原料乳中酪蛋白的pH较大，试验仅对等电点沉淀法进行了碱溶处理。

1.3 指标测定

1.3.1 酪蛋白等电点的测定

首先测定脱脂乳的pH为6.48，然后利用10%的乙酸分别将脱脂乳pH调至4.90，4.70，4.50，4.30，4.10，3.90和4 000 r/min，离心15 min，测定不同pH条件下的酪蛋白沉淀率，比较确定酪蛋白沉淀的最适pH。

1.3.2 离心沉淀率的计算

称空离心管的质量，记为m0；将调好pH的脱脂乳加入到空离心管中，记为m1；4 000 r/min，离心15 min，倒去上层清夜，然后将离心管倒置10 min左右，称其质量，记为m2。按式（1）计算离心沉淀率。

1.3.3 酪蛋白的亚基分子量的测定及纯度鉴定

分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为3%，凝胶厚度为1 mm的垂直不连续SDS-PAGE，电极缓冲液为pH 8.3的SDS，Tris-Gly，开始电泳时的电流为15 mA，样品进入到分离胶后，电流增至30 mA。电泳结束后，将得到的凝胶依次进行固定，染色，脱色，直至蛋白质条带清晰且凝胶蓝色基本退去为止。以分子质量14.4～116 kDa的标准蛋白为标准来观察分析所得到的蛋白质条带。

1.3.4 酪蛋白的乳化性质的测定[13]

取5 mL大豆油与15 mL酪蛋白溶液混合，均质1～2 min，迅速倒入100 mL烧杯中，立即用移液枪从距乳浊液底部0.5 cm处取100 μL，再用质量分数为0.1% SDS溶液稀释至10 mL，测定500 nm处的吸光度。10 min后再以同样的方法稀释并测定吸光度，用0.1%的SDS溶液做空白对照，重复测定5次。得到的吸光度与初始值用来衡量乳化活力指数（EAI）与乳状液稳定性（ES）。

式中：T=2.303；A500nm——500 nm波长处的吸光度；N——稀释倍数；φ——乳化液中油相所占的体积分数；L——比色杯直径，cm；ρ——样品溶液中蛋白质质量浓度，g/mL；A0——0时刻的吸光度；A1——10 min后的吸光度。

1.3.5 酪蛋白的浊度的测定[14]

分别用移液器取酪蛋白溶液1 000 μL，用去离子水稀释至5 mL，在室温，633 nm条件下，以去离子水为参比溶液，测定样品溶液的吸光度，平行测定5次，取平均值。

1.3.6 酪蛋白的热稳定性分析[15]

用热重分析法（Thermogravimetric analysis，TGA）对酪蛋白纯品进行热稳定性分析。仪器打开待稳定后，取5 mg左右的酪蛋白纯品于铝质样品盘中，密封并放置于样品舱中，采用20 ℃～200 ℃的程序式升温方式，速率为10 ℃/min；所通气流为氮气，速率为100 mL/min。空铝质盘作为对照。至少平行测定3次。

1.4 数据处理与分析

所有数据利用Excel表格进行统计处理，利用Origin 8.0作图，IBM SPSS Statistics 19.0软件结合F-分布临界值表进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 酪蛋白等电点的测定

酪蛋白的沉淀率见表1，发现除pH 3.90与pH 4.10和pH 4.30之间差异不显著外，其余各pH组之间均达到显著或极显著性水平，故羊乳酪蛋白沉淀的最适pH为4.10，这与Recio等[16]对羊乳酪蛋白等电点的研究结论是一致的，与邵锦震等[17]研究的牛乳中酪蛋白沉淀的最适pH为4.80不同，进一步论证了羊乳与牛乳的酪蛋白存在差异。

表1 不同pH对酪蛋白沉淀率的影响

pH 4.904.704.504.304.103.90 1 4.987.5616.1818.1319.2118.92 2 5.117.3215.5818.3919.1818.55 3 4.916.8416.9218.5019.1118.92 X重复±SD5.00±0.10a7.24±0.37b16.23±0.67c18.34±0.19d19.17±0.05e18.80±0.21de注: 不同字母代表差异显著 ( p＜0.05)

2.2 SDS-PAGE电泳条带分析

参照文献[18]并结合图1可知，羊乳酪蛋白主要集中在电泳图谱的中分子量组，约20～40 kDa，分为α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，与牛乳酪蛋白种类相同，且以β-酪蛋白含量最多，这与张歌[19]的研究结论是一致的；图1（左）中纯品酪蛋白的三条电泳条带清晰明了，无明显的融合和拖尾现象，虽仍有一些模糊的条带，可能是电泳过程中电流不稳定，但这对羊乳酪蛋白纯度的影响微乎其微；碱溶酪蛋白则基本没有模糊的条带，但是κ-酪蛋白条带不太清晰，可能是因为碱溶酪蛋白对κ-酪蛋白存在一定的影响。图1（右）中酪蛋白的三条电泳条带的分离基本上没有模糊条带，但存在拖尾现象并有轻微的弥散，可能是高速离心过程中存在少量的脂肪残余。

图1 羊乳酪蛋白SDS-PAGE电泳图谱

M代表蛋白质中分子量Marker；左图为等电点沉淀法制备的酪蛋白，1～3代表固体酪蛋白，4～5代表碱溶酪蛋白；右图1～2为高速离心法制备的固体酪蛋白

2.3 酪蛋白的乳化性质

pH影响由蛋白质稳定的乳状液的形成和稳定，在等电点具有高溶解度的蛋白质具有最佳的乳化性质；在等电点溶解度最低的蛋白质以高黏弹性紧密结构形式存在，可防止蛋白质伸展或在界面吸附，缺乏静电推斥力，不能稳定油滴的表面电荷，乳化能力降低，不利于乳状液的形成，但是可以稳定已吸附的蛋白质膜，阻止表面形变或解吸，有利于已形成的乳状液维持稳定，且pH越偏离等电点，乳化性质越好[20]。与高速离心法相比，等电点沉淀法得到的酪蛋白溶液的乳化活力与乳状液稳定性均一性好，但乳化活力较低，乳状液的稳定性较差；两种方法所得到的酪蛋白溶液的乳化性质具有显著性差异，如表2所示。这是因为乳酪蛋白在等电点时溶解度最低，而高速离心法得到的酪蛋白pH与原料乳pH一致。

表2 酪蛋白的乳化活力指数（EAI）与乳状液稳定性（ES）

指标平行X ±SD 12345 EAI/m2·g-1A5.986.686.466.266.566.39±0.28aB5.435.485.435.095.285.34±0.16bES/%A0.580.480.490.520.500.51±0.04aB0.360.370.340.410.360.37±0.03b注: 不同字母代表差异显著 ( p＜0.05)

2.4 酪蛋白的浊度

酪蛋白溶液的浊度大小与吸光度成正相关，由表3知，高速离心法得到的酪蛋白溶液的浊度大于等电点沉淀法。说明高速离心法得到的酪蛋白溶液胶体的光散射强度，胶体聚集程度均高于等电点沉淀法；两种方法所得的酪蛋白溶液的浊度具有显著性差异。相比于高速离心法，等电点沉淀法得到的酪蛋白溶液胶体比较稳定，不易发生解聚作用，酪蛋白胶束之间的相互作用比较稳定，这可能是因为高速离心法得到的酪蛋白可能混有脂肪和磷脂类物质，还有一些乳清蛋白没有与酪蛋白彻底分开，导致所得的酪蛋白溶液胶体聚集程度较大。

表3 酪蛋白浊度的吸光度

样品平行X ±SD 12345 A1.3461.3181.3111.3201.3421.327±0.016aB0.0420.0450.0480.0420.0430.044±0.003b注: 不同字母代表差异显著 ( p＜0.05)

2.5 酪蛋白热稳定性分析

图2中，在20 ℃～200 ℃的程序升温范围内，酪蛋白的热稳定性随着温度的升高而降低，这与张富新等[21]的研究结论一致。图2（左）中酪蛋白质量变化迅速（Δm=0.40 mg），失重速率整体上呈现先降低后不变最后缓慢变化的趋势；图2（右）中酪蛋白质量变化缓慢（Δm=0.85 mg），失重速率呈现波浪式的变化趋势。图3中，由热流的变化知两种方法提取的酪蛋白的变性温度均在115 ℃～120 ℃左右，说明了两种方法的提取均不会影响酪蛋白的变性。采用等电点沉淀得到的酪蛋白表面覆盖着一层乙酸，对酪蛋白具有一定的保护作用，稀乙酸溶液受高温极易挥发，使酪蛋白的pH不断发生改变，影响酪蛋白表面吸附膜的带电情况，从而影响酪蛋白的稳定性，故酪蛋白质量开始变化迅速；采用高速离心法得到的酪蛋白可能掺杂有乳清蛋白，脂肪以及磷脂类等物质，这些杂质在升温过程中和酪蛋白一起发生着不同的变化，使酪蛋白的质量变化缓慢且呈现波浪式的变化。