UHPLC

摘要：采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱系统建立了检测抗病毒药物金刚烷胺 (Amantadine) 的分析方法。猪肉样品经提取金刚烷胺后, 采用基于QuEChERS原理的EMR快速分散固相萃取进行净化, 使用亚2 μm粒径的反相C18色谱柱进行分离, 经配有电喷雾离子源的三重四极杆液质联用仪在正离子模式下监测。该方法在1.0~50 ng/mL浓度范围内线性良好, 相关系数R2=0.999 2; 在1.0, 5.0和10.0 μg/kg 3个水平的平均添加回收率为80.6%~90.5%,检出限为0.5 μg/kg, 精密度为2.1%~3.1% (n=6)。通过对方法灵敏度、精密度和线性范围等参数进行考察, 得到所建立的方法能在10 min内对抗病毒药物金刚烷胺完成快速、准确、高灵敏度的检测分析, 完全满足法规监测要求。

关键词：超高效液相色谱串联质谱; 金刚烷胺; QuEChERS; 猪肉

央视曾经曝光山东等地部分养殖户在肉鸡饲养过程中大量滥用抗生素、激素和抗病毒类药物，违规喂食金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒药品的“速成鸡”流入上海某企业旗下餐饮机构一事的风波，引发上海人士和全国消费者的广泛关注和担忧。金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药物[1-2]，但滥用就有致畸性，可导致精神病患者精神分裂症状加重，并出现难治性双下肢水肿，对中枢神经系统造成不良影响[3-4]。抗病毒药物金刚烷胺并不仅仅被滥用于鸡类的饲养过程中，同样存在着滥用与猪类饲养过程中的高风险。我国作为世界上最大的猪肉生产国和消费国，占据世界猪肉总产量的一半，目前为止仍然没有猪肉中抗病毒类药物金刚烷胺检测的国家标准和方法，只有鸡肉鸡肝中等相关的地方标准[5-6]。但是相对于鸡肉的高蛋白低脂肪的特性来说，高脂肪含量的猪肉给检测就带来了更加复杂和困难的问题，要更好的去除基质效应，这一系列因素都为相关政府执法检测部门、生产企业和第三方实验室迅速开展监督检测带来了技术上的困难。

QuEChERS是由美国农业部Anastassiades教授等于2003年开发的[7]，近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术[8-11]。QuEChERS相对经典SPE净化具有稳定可靠、分析速度快、经济性等显著的优点。试验建立的方法，使用0.2%甲酸乙腈提取猪肉中金刚烷胺、采用基于QuEChERS原理的Agilent? EMR快速分散固相萃取进行净化、超高效液相色谱串联质谱法（UHPLC-MS/MS）检测。方法具有简单快速高通量，回收率稳定，灵敏度高重现性好的特点，能对低浓度金刚烷胺进行定量分析，也能够为有关部门的监管提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Thermo Scientific? Ultimate 3000超高效液相色谱串联Quantum Access Max型三重四极杆质谱；高速均质机；超声波清洗器；Thermo LP Vortex Mixer涡旋振荡仪；Hitachi CF16RN高速冷冻离心机；卢湘仪牌TG1650-WS型台式离心机。

甲醇HPLC、乙腈HPLC、甲酸HPLC：Merck?；超纯水；Agilent? QuEChERS：Extract Tubes with salts，dSPE EMR，Final Polish EMR。

金刚烷胺标准品≥99.0%：Dr. Ehrensorfer。称取标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL。贮存于-20 ℃冰箱中，有效期6个月。使用液逐级稀释，工作曲线现用现配。

1.2 分析条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱，Waters? UPLCBEH C182.1 mm×100 mm，1.7 μm；柱温30 ℃；流速200 μL/min；流动相：A为0.2%甲酸水溶液，B为甲醇；进样体积5 μL；梯度洗脱程序：0～1 min，A从90%下降到10%，B从10%上升到90%，1～6 min，A保持10%，B保持90%，6.1～10.0 min，A保持90%，B保持10%。

1.2.2 质谱条件

离子源和扫描方式，ESI+；检测模式，SRM；电喷雾电压3 500 V；鞘气压力30 Arb；辅助气压力5 Arb；离子源温度350 ℃；离子传输管温度300 ℃；金刚烷胺的质谱参数见表1。

表1 金刚烷胺的质谱参数

(m/z)透镜电压碰撞能量/ eV金刚烷胺152.1/92.9152.1/135.28125 152.1/135.28114名称定性离子对(m/z)定量离子对

1.3 样品处理

称取2 g样品，置于EMR套装中Extract Tubes中，加入盐包和10 mL 0.2%甲酸乙腈，盖紧盖子涡旋振荡5 min，然后以8 000 r/min速度离心5 min，将5 mL乙腈萃取液移至用5 mL水活化后的EMR dSPE 15 mL试管中，涡旋混合并离心。移取5 mL上清液至EMR Polish盐析萃取管中。涡旋混合，离心后乙腈相与水相上下分层，将上层乙腈萃取液过0.2 μm有机相滤膜后进样。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的优化

乙腈在有效提取目标物的同时具有沉淀蛋白的作用，且其带出的弱极性成分，反应在质谱上响应高、基质影响小，因而选用乙腈作为提取溶剂。金刚烷胺分子结构中带氨基，易溶于酸性试剂，在有机溶剂中添加一定比例的酸提取可显著提高回收率[12-14]，故考虑向其中加入一定量的酸性溶液，试验采取了不经其他步骤处理的检测，仅考察乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈和0.5%甲酸乙腈4种提取溶剂，对10.0 μg/kg浓度的加标进行回收率对照实，结果见表2。

试验结果表明，用0.2%甲酸乙腈溶液作提取剂，提取时间5 min，回收率较高，如果选择提取10 min则时间过长且没有显著性提高回收率，因此选择0.2%甲酸乙腈为提取液并提取5 min。

表2 不同提取溶剂对猪肉中金刚烷胺的回收率的影响

回收率/%乙腈0.1%甲酸乙腈0.2%甲酸乙腈0.5%甲酸乙腈285.790.292.791.9 590.694.396.195.0 1090.994.896.495.2提取时间/ min

2.2 色谱柱的选择和色谱条件的优化

分别比较了作为主流品牌的Agilent公司的ZORBAX SB-C181.8 μm，100×2.1 mm（i.d），Thermo公司的Hypersil GOLD 1.9 μm，100 mm×2.1 mm（i.d），Waters公司的ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm，100 mm×2.1 mm（i.d）3款C18色谱柱。金刚烷胺含有极性基团氨基，相对而言在ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱上具有较好的保留和峰形，因此选Waters公司的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱对猪肉中金刚烷胺残留进行检测。同时对流动相、流速和梯度洗脱程序进行了优化，最终采取流速为200 μL/min，以0.2%甲酸水溶液和甲醇进行梯度洗脱，在此条件下金刚烷胺都有较好的峰性和保留。金刚烷胺标准品和加标样品的选择性反应监测（SRM）谱图见图1和图2。

图1 金刚烷胺标准品SRM谱图

图2 金刚烷胺加标样品SRM谱图

2.3 净化方法的比较和优化

类似地标DB21 2394—2014“食品安全地方标准鸡肝和鸡肉中金刚烷胺、金刚乙胺的检测超高效液相色谱串联质谱法”等许多标准以及文献中关于净化都采用了MCX等阳离子交换固相萃取柱进行净化，该净化方法比较经典但相当繁琐，需要活化清洗上样淋洗再洗脱后氮吹复溶等一系列复杂操作，一旦样品量增大耗时呈几何倍数增长，并且由于猪肉的基质相比鸡肉更加复杂，油脂含量高，即使过了MCX小柱后，经过氮吹仍然有一定量的油脂，大量进样不仅会使质谱的响应变低甚至污染，同时色谱柱的寿命也大大降低。经过反复试验和考察，最终采取Agilent公司的EMR强力去脂快速分散固相萃取净化套装来进行净化，整个过程只需提取、去脂、反萃3个步骤即可完成前处理过程，并且通过该方法配制的基质标准曲线的线性满足要求，同时回收率和精密度也都理想，相比较以上地标方法检测金刚烷胺而言，具有更加快速、准确的特点。

2.4 线性范围与检出限

为消除猪肉这种复杂基质造成的基质效应的影响，用阴性猪肉基质配制浓度1.0，5.0，10.0，25.0和50.0 ng/mL的金刚烷胺标准溶液系列，按照上述分析条件进样，绘制标准曲线。结果表明，金刚烷胺在1.0～50.0 ng/mL浓度范围内线性关系较好，相关系数R2=0.999 2，方法显示了良好的线性关系。在空白样品加标回收试验中，以3倍信噪比和10倍信噪比确定方法的检出限和定量限，再综合考虑样品复杂的基质，确定方法的检出限为0.5 μg/kg，定量限为1.5 μg/kg。金刚烷胺的线性方程、相关系数、检出限、定量限见表3。

表3 金刚烷胺的线性方程、相关系数、检出限、定量限

目标物质线性方程相关系数检出限/ μg·kg-1定量限/ μg·kg-1金刚烷胺Y=180 767+318 972X0.999 20.51.5

2.5 方法回收率和精密度

选取阴性猪肉样品，每份准确称取2 g，按1.0，5.0和10.0 μg/kg 3个水平添加金刚烷胺，在优化后的条件下进行前处理并上机测定，每个水平平行测定6次，计算回收率和精密度。其平均回收率为80.6%～90.5%，变异系数RSD为2.1%～3.1%，可以作为日常检测和确证方法使用。金刚烷胺回收率和精密度见表4。

表4 金刚烷胺的回收率和精密度

目标物质RSD/ %金刚烷胺添加水平/ μg·kg-1回收率/%平均回收率/% 1.077.580.282.979.183.477.980.63.1 5.086.985.783.289.087.684.186.52.5 10.092.889.787.991.590.588.290.52.1

3 结论

采取基于QuEChERS原理的Agilent EMR强力去脂快速分散固相萃取净化手段以及UHPLC串联质谱相结合建立了检测方法，以应对较高脂肪含量的猪肉中金刚烷胺残留的检测，通过优化提取溶剂、前处理净化手段、色谱条件和质谱条件，提高了分析效率，显著缩短了净化程序和分析周期，能够准确、快速检测猪肉中的金刚烷胺残留，在1.0，5.0和10.0 μg/kg 3个添加水平下，平均回收率为80.6%～90.5%，变异系数RSD为2.1%～3.1%，可以作为定性、定量的确证方法。该方法无需使用SPE固相萃取小柱，省去了繁琐的活化上样清洗氮吹等步骤，操作简单，大大降低了检测时间和人力成本，是一种快速、灵敏、实用的方法，适用于大批量猪肉及其制品中金刚烷胺残留的快速检测和确证。

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Determination of Amantadine Residues in Pork Using UHPLC-MS/MS

Sun Jie
Shanghai Nutrition Food Quality Supervision & Inspection Center/Shanghai Yuanben Food Quality Inspection Co., Ltd. (Shanghai 200082)

Abstract：The UHPLC tandem triple quadrupole mass spectrometer system was used to establish testing antiviral drugs amantadine analysis method. Based on the principle of QuEChERS EMR quickly dispersive solid-phase extraction for purification, pork samples after extraction of amantadine were monitored by the triple quadrupole mass spectrometerequipped with electrospray ion source in the positive ion mode after using 2 μm diameter reversed-phase C18chromatographic column to separate. The method in 1.0～50 ng/mL had a good linear correlation in the concentration range, and the correlation coefficient R2was greater than 0.999 2; the average recovery of the method by adding three levels (1.0, 5.0 and 1.0 μg/kg) wasin the range from 80.6% to 90.5%; the limit of detection was 0.5 μg/kg, and the precision wasin the range from 2.1% to 3.1% (n=6). By researching the method parameters such as sensitivity, precision and linear range, it showed that the method wasrapid, accurateand highly sensitive; the detection analysiscould be completed within 10 min, and couldfully meet the requirements of regulations monitoring.

Keywords：UHPLC-MS/MS; amantadine; QuEChERS; pork