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在转录本分析中，tophat2是近年来最常用的工具之一，可以将RNAseq的reads数据map到基因组上，找出外显子之间的结合位点。tophat2的下游软件是cufflinks，通过cufflinks我们就可以找到不同样本间的差异基因，进而进行后续的GO，KEGG分析等，所以说tophat2是转录本分析中的非常重要的一个中间工具。 tophat2的安装需要依赖三个软件：boost，samtools和Bowtie2。这三个软件安装完成后即可安装tophat2，命令如下: cd tophat ./configure make make install 下面来为大家讲解写tophat2有参比对的用法： tophat –p 20 –o output –G genome.gtf genome reads_1.fa reads_2.fa -p 为安排运行tophat所需要的CPU线程数，根据服务器端的CPU总线程数来决定。 -o 为文件输出路径，一般建议每个样单独建立一个文件夹。 -G 后面跟着相应参考基因组的注释文件，在运行时会首先被tophat2调用bowtie2建立index，这个过程会占用一定的时间。 genome，样品物种的基因组index，可用bowtie2-build对物种的genome.fa文件进行建库，命令为：bowtie2-build genome.fa genome ，此命令建立index也需要花费较长的时间。 tophat既支持pair-end数据，也支持single-read数据。 此外，tophat的常用参数还有： -r 成对的reads之间的平均inner距离，默认为50。 --library-type Tophat2处理的reads具有链特异性。一般Illumina数据的默认library-type为fr-unstranded。 输出的结果主要有以下几部分： accepted_hits.bam reads排序的结果以bam格式生成文件，是后面cufflinks软件的输入文件。 junctions.bed deletions.bed insertions.bed 这三个分别是tophat处理的junctions，删除和插入的结果。 unmapped.bam 没有map上的序列 align_summary.txt 可以查看map上的reads所占的比例。 01 此类问题常见于第一次使用tophat时，部分tophat所调用的软件没有配置好。如上，将bowtie2-build在/usr/local/bin目录下建立软连接即可解决。 02 此问题的初心一般为注释文件.gtf和基因组的信息在染色体上格式的不匹配造成的，例如本例中的注释文件.gtf的1号染色体标识为chr1，而基因组.fa的1号染色体标识为1，导致两个文件相互无法识别。解决的办法是，将注释文件.gtf的chr1转换成1，操作代码为：sed 's/^chr//g' piggenome.gtf > piggenome1.gtf 。 03 关于tophat2程序后台运行的问题 可以使用nohup 命令 & 运行tophat2，这样可以后台同时挂多个tophat2程序，但是-p的值要根据服务器端的线程数进行设置，如总服务器CPU线程为56个，后台挂了6个tophat2程序，则单个-p值不应该超过9。可以用more nohup.out查看运行进度。 04 解决每次运行tophat2都要对注释文件建index的问题 每次用tophat2都要先进行注释文件建库会占用太多时间，所以我们可以提前建好index一劳永逸，使用命令：tophat –G XXX_genes.gtf --transcriptome-index=transcriptome_data/XXX genome（基因组index） 建立注释文件.gtf的index，对应的，使用的tophat命令改成：tophat –p 20 –o output --transcriptome-index=transcriptome_data/XXX genome reads_1.fa reads_2.fa |
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