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各位酸谈的朋友，我是老谈，这是我在酸谈上第一篇文章。 文/老谈
大家好，我是老谈，从7月份开始，我全职回到了解螺旋团队，与酸菜重新合体，作为6年多的合作搭档，我们之间的默契不言而喻。
酸菜《三十六策》珠玉在前，我就不费心讲解基础科研理论知识了，利用自己长期的科研积累和学位品味，采撷学术前沿的闪耀光芒，启迪你我的创新思维，这便是我努力在做的一点尝试。
我在《最前沿》栏目连续讲了五期肿瘤转移的话题，大家不一定有时间全部听下来，今天选其中一些重要的观点馈赠知音。
肿瘤转移，不是一个简单的过程。这一问题的认识至少要分为五个渐次展开的步骤： 1）原发肿瘤的局部侵袭影响到周围的组织，尤其是基质细胞； 2）脱落的肿瘤细胞通过內渗的方式进入循环系统； 3）进入循环系统的肿瘤细胞要在流动的环境下生存； 4）循环系统内的肿瘤细胞通过外渗的方式迁移出循环系统； 5）肿瘤细胞进入远处转移的组织内，形成微小的转移克隆，再通过增殖形成可见的转移灶。
这就相当于肿瘤转移研究的细分方向，也是基金申请中不同的科学问题，在每一个步骤上，近年来都有新的学术成果产生，从而不断丰富我们对肿瘤细胞转移机制的认识。
肿瘤细胞的脱离（dissemination）
Dissemination是肿瘤转移侵袭的第一步，脱离使肿瘤细胞具备了离开原发灶，发生远处转移的能力，是发生转移的前置条件。其中最受瞩目，并且被研究最深入的细胞生物学过程就是上皮间质转化（EMT）。
EMT最早是在胚胎发育中发现的一个现象，在成体的表皮细胞受到损伤之后，也会出现相应的EMT现象。但在肿瘤细胞的发生发展过程中，也会通过EMT，使肿瘤细胞丢失了部分上皮细胞的特性，来获得一些间质细胞的特性，也让肿瘤细胞获得了更强的侵袭和脱离能力。
在不同组织中、在肿瘤细胞不同的恶性条件下、不同的细胞内外通路中，EMT的作用机制都是有差别的。EMT的过程是由一系列的相关转录因子进行调控，研究最为广泛的是Snail、Twist和Zeb1。 文献内容具体可看滑动框 在2015年的一篇Nature论文中，通过基因敲除胰腺癌小鼠模型中的Twist和Snail之后，对于肿瘤细胞的转移几乎没有影响。但到了2017年的NAT CELL BIOL的论文中却发现了完全相反的结论，敲除了Zeb1后显著的影响了癌细胞的侵袭和转移。这两项相反的研究成果也在一定程度上证实了EMT的作用机制很可能与肿瘤类型相关。 其他EMT转录因子，例如Zeb2等虽然也有一些研究报道，但在肿瘤转移中的作用仍然不够明确，如果想深入研究肿瘤转移的机制，可以考虑上述非常见的EMT转录因子。 现在绝大多数认为，肿瘤的转移发生在肿瘤进展的晚期。但最近的一些研究证明，肿瘤细胞获得EMT相关的表型并发生脱离，是一个很早就发生的现象，甚至可能发生在癌前病变时期。这个现象最早是在2008年的一篇Cancer Cell论文上进行了报道，在小鼠模型和患有乳腺导管癌的女性患者中，都发现肿瘤细胞在早期就发生了脱离。之后在2012年的Cell上，也在胰腺癌中发现了类似的现象。 研究人员在胰腺癌小鼠模型中标记了胰腺上皮细胞并进行追踪，结果发现，被标记的细胞通过EMT在胰腺癌形成前就能进入血液循环系统。而且进入循环系统的是胰腺细胞，不是胰腺癌细胞，因为这个时候胰腺癌还没形成。这些胰腺细胞有间质细胞的表型还有干细胞的特性，并且能在肝脏驻留形成转移灶。
传统观点认为，EMT现象的发生使肿瘤细胞从表皮细胞的特性转向间质细胞的特性。但其实EMT更像一种双向调节的开关，可以使肿瘤细胞获得部分间质细胞同时，也保留部分表皮细胞的特性。
肿瘤细胞要启动EMT往往是受到细胞内和细胞外多条信号通路的结果，尤其是肿瘤相关基质细胞。EMT过程是个可逆的过程，肿瘤细胞同样可以通过间质上皮转化（MET），从间质细胞转变为上皮细胞。
现在的观点认为，表皮细胞状态和间质细胞状态只是细胞过程的两个极端，当中还有很多的中间态。对于肿瘤细胞而言，表皮细胞形态是0，间质细胞形态是1。原来观点认为，肿瘤细胞要么是0要么是1，事实上，肿瘤细胞可以在之间的任意一个状态。这种中间态的发生取决于细胞本身和周围环境的影响。
现在EMT的研究领域还有许多重要的问题没得到解决，概括下有这些：
1、由于EMT机制极其复杂，在不同的肿瘤中，没有一种靠谱的方法可以预测到底是那种关键转录因子在发挥作用。是否能够在今后的研究中找到一种靠谱的研究方式，这对于EMT的研究将有重大的推动作用。
2、细胞内和细胞外的多种不同信号通路是如何协同作用在肿瘤细胞上的，并且激活了肿瘤细胞发生了EMT现象。
3、虽然已经知道EMT对肿瘤细胞的转移是非常重要的，但肿瘤转移是一个多步骤的阶段，那在不同阶段EMT所起的作用是一样的吗？如果不一样，那EMT在不同的肿瘤、转移的不同阶段中，作用有哪些不同，也不清楚。
4、不同组织来源的正常细胞的分化能力对于肿瘤细胞内EMT的激活，以及EMT过程中不同转录因子的表达是否有重大的影响。
5、EMT过程中包含很多转录因子，这些转录因子在不同的肿瘤类型中是如何相互协作，介导肿瘤细胞发生EMT现象的。
6、原发灶的肿瘤细胞内发生的T细胞突变是否可以影响EMT的发生和表达。
7、细胞内和细胞外的信号通路如何调控肿瘤细胞内已经发生的EMT现象。
在国自然申请中肿瘤转移始终是一个热点，如果可以针对上述的这些问题设计相应的实验，论述相应的观点，可在千篇一律的EMT标书中脱颖而出。
协同转移现象（Collaborative migration）
EMT是肿瘤转移过程中非常重要的机制，但EMT并不是唯一的机制，研究发现还有一种协同转移的现象在某种程度上可以认为是EMT非依赖的介导肿瘤细胞脱离的机制。
一般肿瘤细胞发生转移都是单个细胞发生EMT，并降低了细胞间的粘附。但在2012年发现，原发灶肿瘤不再以单个细胞的形式发生侵袭和转移，而是一大群细胞团伙作案，这就是协同转移现象。这一大团细胞中，在转移前缘的细胞具有明显的间质细胞表型，但是之后的细胞又具有明显的上皮细胞表型。这种协同转移的现象在乳腺癌和肺癌中都有报道。
肿瘤细胞除了通过细胞团的方式发生协同转移外，还能利用肿瘤相关基质细胞的帮助形成协同转移。比如，肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）就可以和肿瘤细胞之间通过力学作用发生转移。
循环肿瘤细胞（CTC）
在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞会以內渗的方式进入循环系统，被成为循环肿瘤细胞（CTC）。这些细胞可以通过循环系统到达远处组织形成肿瘤转移克隆，它们在循环系统中一般只能循环几秒到几分钟的时间。随后这些CTC就会滞留并进入小口径的微血管腔内，一般认为，微血管腔直径只要达到8 μm就能捕获CTC。那这些CTC的大细胞团是如何穿过小直径的微血管腔呢？
2016年有文献报道CTC可以以单细胞链的方式穿过微血管腔，在这种结构中细胞与细胞之间通过粘附的形式收尾相连通过狭窄的微血管腔。CTC团相对于单个CTC有更能在远处组织形成转移克隆，因为细胞团能更有效的抵抗凋亡，且可以更好的驻留在微血管管腔内。这种抱团的形式更能抵御其他细胞的攻击，比如NK细胞。所以CTC团能更有效的形成远处转移。 这些年CTC分离和测序技术不断发展，研究人员可以很方便的从患者血液中分离CTC。从而进行单细胞测序研究。2015年有研究发现CTC和原发灶肿瘤细胞以及转移灶肿瘤细胞都不相同，可以认为CTC是原发灶肿瘤细胞和转移灶肿瘤细胞之间的中间过渡状态。Science上也有研究证实CTC既表现出表皮细胞的特性，也表现出间质细胞的特性，因此呈现出混合细胞效应。
但是对病人来说，随着治疗抗性的出现，患者血液中越来越多的CTC表现出了间质细胞的特性。而现在CTC富集技术主要是通过表皮细胞的marker来进行的，例如CK角蛋白。但也不能因此而否认CTC的临床应用价值，在乳腺癌，前列腺癌，肺癌和结直肠癌中，CTC可以作为一种比较可靠的诊断标志物。长时间追踪病人血液中CTC的数量也可以为临床判断肿瘤转移提供一种参考。
內渗后的肿瘤细胞
肿瘤细胞內渗进入引流淋巴结是临床上的一个重要参考指标，和肿瘤TNM分期和预后密切相关。虽然，现在研究最多的还是肿瘤细胞內渗入血管，但对于內渗入淋巴管的研究也越来越多了。
CTC在血流中的时间非常短，而且会碰到很多麻烦，比如缺少底物支持、血液流速影响、血流剪切力的影响，还会受到免疫系统攻击。这就让CTC更倾向与血液中的其他细胞联合，如血小板、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞等。
CTC与血小板
CTC可以迅速通过肿瘤细胞表面的因子与血小板相互作用，如果肿瘤产生的CTC过快，则会影响原本处于稳态的凝血作用。失衡的凝血作用在部分肿瘤体内会导致凝血综合征，出现微血栓、DIC甚至是肺栓塞。另一方面，血小板也促进的肿瘤细胞转移，诱导出现血小板减少症后可以明显减少肿瘤转移，而患者血小板数目过高，往往预后较差。
原因在于，血小板中有大量生物活性分子，能明显影响肿瘤进展，血小板还能够起到保护CTC免于受到自体免疫的攻击。具体机制有以下两种：
1、血小板分泌可溶性因子，如TGFβ，来抑制NK细胞的活性； 2、通过与肿瘤细胞的相互作用，在其表面形成了一层以血小板组成的保护膜，防止被免疫系统识别。
血小板还可以改变肿瘤细胞内的重要信号通路，使肿瘤细胞更容易形成转移。在循环系统中，阻断血小板与肿瘤细胞的相互作用能够促进CTC通过MET转变成具有表皮细胞特性的细胞类型，丧失了侵袭转移和肿瘤起始能力。肿瘤细胞对血小板也有反向调节作用，肿瘤细胞可以激活血小板，促使血小板分泌更多的ATP，通过表达P2Y2受体增加了血管渗透性。
CTC和中性粒细胞
在某些情况下，中性粒细胞会抑制肿瘤转移。肿瘤细胞通过分泌CCL2激活中性粒细胞，这些激活的中性粒细胞在转移前就会积聚在循环系统中，它们能够明显的抑制肿瘤转移。但现在绝大多数观点还是认为中性粒细胞对于肿瘤转移有促进作用。
机制1：中性粒细胞通过NET机制识别并杀死病原体。有研究表明，中性细胞也能够通过NET识别肿瘤细胞，但并不杀死，相反会促进肿瘤细胞转移。为什么会出现这种情况，不知道……
机制2：中性粒细胞可以促进肝脏内血窦的连接，CTC会在这些黏连血窦中驻留粘附，更容易发生进一步外渗。
机制3：中性粒细胞可以抑制血管管腔内的NK细胞对肿瘤细胞的攻击。
写标书的时候，第一种做法就是：研究肿瘤转移，扯一点EMT相关的转录因子；第二种是研究肿瘤细胞一內渗的方式进入循环系统，然后通过某种机制与循环系统中的某类细胞进行勾搭。这种更有吸引力。
肿瘤细胞外渗
通过以上这么多机制，最终都是为了让肿瘤细胞更容易的从血管内壁外渗到远处组织，形成转移克隆，这个过程又被称为跨内皮迁移（TEM）。之前就提到过肿瘤细胞能与血小板相互作用分泌ATF是血管的渗透性增强。 单核细胞也参加了肿瘤细胞的外渗，有研究报道，在肺转移过程中，肿瘤细胞会分泌CCL2作用于CCR2表达阳性的单核细胞。单核细胞受到了CCR2、CCL2信号的激活促进了肿瘤细胞的外渗和转移克隆。 CCL2-CCR2信号轴在肿瘤外渗和转移过程中起到了非常重要的作用，因此有些临床研究希望通过抑制CCL2-CCR2信号轴治疗肿瘤转移。但结果令人目瞪口呆，阻断了CCL2-CCR2信号轴后，肿瘤转移不仅没有被抑制，还加速了疾病的进展。这也体现了肿瘤转移微环境的复杂性和不可预知性。 在2016年的Nature上报道了一种全新的外渗机制，发现肿瘤细胞通过诱导内皮细胞程序性坏死来发生肿瘤细胞外渗，并在肺部形成转移灶。与传统观点不同，他们认为机体除了意外发生的细胞坏死外，机体受到伤害性刺激时还会发生一种程序性坏死，这是一种主动的控制过程。程序性坏死最明显的信号分子就是RIPK1和RIPK3。 肿瘤转移克隆
肿瘤细胞形成微小转移并克隆，是整个肿瘤转移过程的最后一步，也是最致命的一步。进入血管的肿瘤细胞能走到这步的概率非常低，大约万分之一。大部分肿瘤细胞要么被远处组织的免疫细胞清除，要么进入长期静息状态（数周~十数年）。
其原因是，在发生了长距离迁移之后，扩散肿瘤细胞（DTC）周围的微环境被彻底改变了，生长受到了抑制。这很可能是肿瘤细胞采取的一种主动行为，通过进入静息状态，减少自身能量消耗，还可以获得足够长的时间调整自身，适应全新环境。
另一种理论认为，这是一个被动过程，肿瘤不能克服免疫系统的抑制作用，也不能在新的组织中诱导新生血管形成。而且肿瘤细胞通过增殖形成的更多细胞，会因为免疫抑制作用被清除。
除了上述这些，细胞外机制也起到了重要的作用，DTC在进入远处组织后如果不能与整合素 Integrinβ1相互作用，并激活下游的FAK，DTC就会进入静息状态。由此也说明了肿瘤细胞的静息状态依赖于肿瘤细胞和胞外机制的相互作用。
静息的合适位置
DTC可以在远处转移组织的某些区域内存活，这些特定区域可以抑制肿瘤的增殖，但却可以维持肿瘤细胞的存活。这些区域的存在更容易使DTC对化疗或者放疗产生抵抗。静息DTC还会和体内正常干细胞来竞争这个位置，在前列腺癌的骨转移过程中，有人发现转移的癌细胞会和造血干细胞竞争同一片骨内膜区域，也提示了造血干细胞微环境中存在着使肿瘤细胞进入静息状态并保持存活的信号。
那DTC是如何逃过免疫攻击的呢？在乳腺癌和肺癌的DTC进入静息状态同时也开始抑制细胞分泌的能激活NK细胞的因子，从而避免激活NK细胞，从而逃脱免疫系统的攻击。最后，只有保持了肿瘤干细胞特性的DTC才有可能在未来形成转移的克隆。
转移克隆形成机制
DTC在远处组织形成转移克隆依赖两种特性：
1、DTC必须拥有肿瘤起始和增殖能力； 2、DTC必须具有很强的自我调整能力，以适应全新的微环境（种子土壤学说）。
而且DTC在到达远处组织后会进行主动的适应性调整，以适应当地微环境，这也是肿瘤细胞能形成远处转移的最关键原因之一。进入远处组织后，肿瘤细胞进行的主动调整之一在于迫使肿瘤细胞获得生存优势。肿瘤细胞在循环系统以及远处组织内面临更大的氧化应激压力，但肿瘤细胞内会发生主动性的代谢调整，包括抗氧化剂的合成，促进了肿瘤细胞的存活和最终转移灶的形成。
最后，欢迎大家进一步收听《最前沿》栏目，里面有更详细的解读。
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