小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代?
——flamerking图文版，From?DXY?
1.?试剂及材料准备?
DMEM/F12?+10%?FBS培养液?
成分?
DMEM?（Gibco)?1L?
F12?(Gibco)?1L?
FBS?(Hyclone?or?Gibco?or?JRH）200ml?
L‐glutamine?600mg?
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要点：?
a)DMEM与F12各半（即1:1混合），过滤装瓶，后4oC保存?
b)L‐glutamine?600mg溶解于40ml?DMEM/F12?中，过滤（0.22μm?Millipore）后分装入4支
15ml离心管（BD?Falcon)，即每支150mg，‐20oC保存。?
c)每50mlFBS分装入50ml离心管（BD?Falcon），‐20oC保存。?
d)当即将使用时，取出取出1支L‐glutamine放入37oC孵育融解，1支FBS放入4oC冰箱内
过夜融解（如果时间紧，也可37oC下融解）。?
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讨论：?
a)我用过Stem?Cell?公司的小鼠MSC培养基，确实原代培养要比普通的培养基好，主要体现
在细胞贴壁快，克隆形成率高，细胞形态保持地较好。但是价格过于昂贵，即便是我们这样
大实验室都觉得有些贵，我想普通小实验室或者借用实验室做课题的战友来说绝对不是一个
首选，毕竟对于一个课题，细胞培养只不过是漫漫征程的第一步，还没打仗就把粮食消耗光
了，这绝对是兵家的大忌。?
b)溶解了的L‐glutamine容易降解，4oC下保存超过1个月就应该再次添加。因此我是每次使
用前添加血清和L‐glu，这样使得培养基能有最好的活力。?
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PBS?buffer?
成分及要点（略）?
讨论：?
a)使用前一定要37oC孵育，冷的PBS会使贴壁的细胞收缩甚至漂浮起来。?
b)最好在配液后（过滤或高温消毒前）测一下PH值，如果不在7.0‐7.4范围最好是用1MHcl
或1MNaOH进行滴定调整。不过，一般来说，配好的PBS都在这个范围内。?
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RBC?Lysis?solution?
成分：?
0.8%?NH4Cl?
0.1mM?EDTA?
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要点：?
a)过滤消毒为宜。可4oC长期保存（至少4个月）。?
b)细胞来源为小鼠时，与细胞悬液混合比为9：1（9份Lysis，1份细胞悬液）。细胞来源为
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人时，与细胞悬液比为4:1。混匀后冰上孵育5‐10min。?
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PBS+2%FBS?
主要用于获取的股骨和胫骨的临时保存及冲洗。?
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2,动物手术及取材?
材料与设备：?
1)骨髓细胞冲洗液?
2)小镊子/眼科剪刀/血管钳（可选）/无菌手术铺巾?
3)培养皿/离心管?
4)培养液?
5)红细胞裂解液?（可选）?
6)冰盒?
7)其他细胞培养的常规设备及器皿?（具体如下图）?
其中最关键的是冲洗液，配方如下：?
骨髓细胞冲洗液：?
2%?FBS?
PBS?(PH7.2)?
1mM?EDTA?
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2.1?取6‐12周龄C57B/6J雄性小鼠，脱颈处死后，75%酒精浸泡1‐3min；?
注意：?
（1）酒精浸泡时间不宜太长，很多书上要求10min，其实大可不必，最多3min也够了，因
为这些小鼠本来就是在SPF级环境下生长。浸泡时间太长很多组织会被酒精固定，另外动物
死亡时间太长，理论上对细胞活力有影响（实际上我没觉得有什么影响）。?
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（2）酒精浸泡的主要目的除了杀菌外，更重要的是使小鼠的毛发湿润，以便操作（干燥的
毛发会飞得到处都是，污染超净台）。?
（3）乘放酒精的器皿最好放在超净台下角落中，以免操作中打翻引起火灾（本人有一次差
点着火）；但是也别放在脚踢得到的地方，以免打翻污染实验室（本人多次踢翻过）。?
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2.2?将浸泡后的小鼠稍稍晾干（使酒精稍微滴干一下，否则会把开刀巾湿透）转入超净台；?
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自尾巴最近心侧的根部背面用眼科小剪刀剪开皮肤，沿大腿后缘分别向两侧的足跟剪开皮
肤；?
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在皮下稍做钝性分离后，一手抓住尾巴，一手抓住掀起的鼠皮，将鼠皮撕开，使之全身脱套。?
注：脱套鼠皮的目的是暴露术区，并防止鼠毛污染术区和器械；?
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2.3?沿股骨体表投影线（可见一条白色的肌肉交界线），用剪刀钝性插入直接接触骨膜?，向
两侧钝性剥离肌肉及关节处的肌肉附着点，完整取下股骨；同法取下胫骨。?
注：?
（1）剥离干净肌肉是有技巧的，需要一定的操练，由于本人外科基本功比较好，所以剥个
骨头只要30sec就够了，新手可能需要5‐10min甚至更长，须耐心练习。?
（2）如果要做的小鼠数量很多，或者操作者不熟练，使得整个操作时间大于半小时，那么
推荐将获取的股骨和胫骨浸泡入冰上孵育的含有冲洗液或培养液的培养皿。?
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根据需要取下胫骨和股骨，我个人觉得胫骨比较好冲，所以每次都取?
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从处死小鼠到取下双侧胫骨/股骨并剥干净肌肉，我最快只要4min，一般在5min左右。?
请注意：在没有助手的情况下，不要把腿剪下来操作，否则固定不是很方便。?
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2.4?用眼科剪刀将股骨/胫骨从骨干中间剪断，用2ml注射器进行冲洗骨髓腔，直到骨头发
白，收集冲洗下的细胞悬液，转入离心管。?
注：也可以用血管钳将骨段夹碎，然后反复冲洗或震荡漂洗，据说这样能获得更多的干细胞
（我主观上感觉好像确实多些）。?
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接着可以进行红细胞裂解步骤，也可跳过该步骤直接离心后加入培养液进行全骨髓培养。?
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如果不进行红细胞裂解，那么离心后获得的pellet如下图，如果进行了红细胞裂解，那么
pellet的颜色应该是乳白色（可能稍微带点红色，如果裂解不充分的话）。?
对于小鼠，我个人认为不需要进行红细胞裂解。?
2.5?弃上清，用培养液重悬，取出10ul，加入90ul3%冰醋酸溶液后混匀，进行细胞计数，每
1‐1.5×10
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个有核细胞接种一盘10cm培养皿。?
注：3%冰醋酸可以裂解红细胞，无论是否做过红细胞裂解步骤，都应该再经此操作（防止
裂解不充分而混入红细胞，影响计数准确性）；也可加入台盼蓝（细胞:台盼蓝:冰醋酸=1:1:8)，
不过意义不是太大，因为死细胞其实并不多。?
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3,?原代培养?
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4,?细胞传代?
试剂：?
1）?PBS?
（配方略）?
2）0.05%Trypsin?
将原装进口的0.25%?Trypsin/0.1mM?EDTA(Gibco)溶液用PBS稀释5倍，即1份原装0.25%Trypsin
加4份PBS。?
方法：?
1）将PBS及Trypsin?在37度水浴箱内预热；?
2）将要传代的小鼠MSC细胞用PBS洗2次，每次静置0.5‐1min；?
3)?负压吸干PBS，加入0.05%Trypsin?（10cm?盘2‐3ml,?6cm?1‐2ml，能均匀覆盖满盘底就可），
来回晃匀，使Trypsin均匀涂抹覆盖盘底；?
4）37度培养箱内孵育1‐3min?（具体的孵育时间应该在前几次做时自己摸索，如果没有经
验，可以每30sec拿出来在镜下观察，或者干脆完全在镜下观察控制消化时间）。?
5）加入含血清的培养液中止消化（一般10%FBS的培养液加入和所用Trypsin等体积的量就
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足够了）；?
6）吹打盘底，将细胞悬液转入离心管，1500rpm/5min离心；?
7）弃上清，用培养液重悬（所用培养液的量根据具体情况决定）；?
8）细胞计数；（可选）?
9）按1‐2?10^5/cmcm密度接种，或一只小鼠所获得的细胞接种一盘10CM培养皿；?
10）37度5%CO2培养箱孵育。?
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附：?
最近我的小鼠msc长得很好，新的心得如下，供大家参考：?
1，培养基：?
（1）原代20%FBS?(JRH公司）＋alpha‐MEM?
（2）首次换液开始使用10％FBS＋alpha‐MEM，2天半量换液一次（超过3天细胞状态明显
不好）?
2，取材：?
取材得时候我在手法上改进了点，很难言表，主要是把骨头碾碎后反复漂洗，漂洗下来得液
体连同细胞一起离心。?
3，首次传代：?
经过上述2点得改进后，克隆形成率明显增多，8－10天克隆间就融合，并进行首次传代，
接种密度2－2.6×10^6?cells/75cmcm?dish，3天就长满又可以传了。?
4，成年小鼠的MSC好像生长能力比4－6周的强：?
10周以上，我做了12周、30周、55周，感觉生长能力有增无减（只是主观感觉，并没有
进行统计分析）。?
5，Rosa26小鼠好像比C57Bl/6‐TgN小鼠的MSC生长能力强（基因第1点的培养体系）。?
以上是最近的心得。?
至于传代，我有一批细胞已经传到20代了（低密度接种），每天丢掉好几盘细胞，没那时间
去料理。?
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——来自丁香园flamerking原创贴，savid888整理?
2009.5.7?
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