实验时间 | RT-PCR 实验操作

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实验方法原理

逆转录-聚合酶链反应 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR） 的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

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实验步骤

一、总 RNA 的提取

按照总 RNA 提取实验步骤提取组织或细胞中的总 RNA。

二、cDNA 第一链的合成

目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1. 在 0.5 ml 微量离心管中，加入总 RNA 1～5 μg，补充适量的 DEPC H2O 使总体积达 11 μl。在管中加 10 μM Oligo（dT）12～18 1 μl，轻轻混匀、离心；

   
   

2. 70℃ 加热 10 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min；

   
   

3. 取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA   2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl。轻轻混匀，离心。42℃ 孵育 2～5 min；

   
   

4. 加入 SuperscriptⅡ1 μl ,在 42℃ 水浴中孵育 50 min；

   
   

5. 于 70℃ 加热 15 min 以终止反应；
   

   
   

6. 将管插入冰中，加入 RNase H 1 μl，37 ℃ 孵育 20 min，降解残留的 RNA。-20 ℃ 保存备用。
   

三、PCR

1. 取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA   2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；

   
   

2. 加入适量的 ddH₂O，使总体积达 50 μl。轻轻混匀，离心；

   
   

3. 设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28～32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照；

   
   

4. 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

   
   

5. 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

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注意事项

1. 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；

   
   

2. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
   

   
   

3. 内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。

   
   

   其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；

   
   

4. PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。

   
   

   故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；

   
   

5. 防止 DNA 的污染： 采用 DNA 酶处理 RNA；在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。