早期非小细胞肺癌的cfDNA突变检测

ABCmedic 2017-08-23

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在文献解读之前，首先来科普几个概念。

cfDNA:

cell free DNA的缩写，指游离于细胞外的DNA。对于健康的人来说，血液中的cfDNA主要来源是体细胞正常的新陈代谢，应该维持在一个较低的水平。当有严重的系统性器官损伤（肿瘤形成）时，血液中的cf DNA含量增加，甚至在肿瘤形成早期即可以被检测出来，这对于临床检测具有重要意义。

非小细胞肺癌（NSCLC）：

非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。

肿瘤异质性：

不同的肿瘤细胞会表现出不同的形态和表型特征，包括细胞形态，基因表达，代谢，转移能力等。分为肿瘤内异质性(inter-tumour heterogeneity)和肿瘤间异质性(intra-tumour heterogeneity)。

全外显子测序（WES）：

指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。在人类基因中大约有180,000外显子，占人类基因组的1%，约30MB。

扩增子测序：

是一种靶向测序，即对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，主要包括目标区域扩增子测序、16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序等。这种测序方法相对全外显子测序，能在控制成本的前提下，提高测序覆盖度，增强突变检测的灵敏度，处理更多的样本。

在了解以上几个概念后，我们开始进入正题。

背景简介：

目前，很多研究表明固形肿瘤细胞存在明显的肿瘤间异质性，因此通过单一肿瘤组织样本活检，会对准确的临床治疗带来困难。而多组织样本质检又不符合临床操作。因此，从体液（如血浆）中分离cfDNA，进行无创诊断，是极好的方法。那么，问题是cfDNA的mPCR-NGS检测，是否具有代表性和全面性？本篇文章中给了我们答案。

一句话概括：通过cfDNA扩增子测序，鉴定早期NSCLCs的普遍性和异质性突变。

文章思路：

实验样本：

四个非小细胞肺癌患者的癌组织和血样。病人编号（L012, L013, L015, L017 ）。L015选择两处取样位置（R1、R2），另外3个选择三处取样位置（R1、R2、R3），共11区癌组织。4个血样。

（另外，考虑到背景错误率，cfDNA测序数据还包含来源于48个正常捐献者的cfDNA作为阴性对照样本，用于数据处理。）

实验方法：

1. 不同来源、不同位置的肿瘤组织DNA，通过全外显子捕获测序（平台是Illumina HiSeq 2500）和扩增子测序（Ion AmpliSeq deep-sequencing），鉴定SNVs突变情况。

2. cfDNA采用mPCR-NGS测序，鉴定SNVs。从1-1.5 ml血浆中分离cfDNA，通过hgDNA Quantiﬁcation and QC Kit对cfDNA的浓度和完整度进行质检，然后构建扩增子文库，进行高通量测序检测。

3. 分析比较肿瘤组织和cfDNA的测序结果，判断cfDNA扩增子测序是否能够鉴定早期NSCLCs的普遍性和异质性突变。

实验结果：

1.通过对11个癌组织区域进行全外扩增子测序，确认了非小细胞肺癌存在肿瘤间异质性，与前人研究结果一致，具体结果如下图所示。

2.根据全外扩增测序结果，在肿瘤DNA和cfDNA中选取了50个SNVs位点进行mPCR-NGS测序。结果如下表，其中12个测序reads数低，不计入结果，另外37个位点中，有25（68%）个SNVs位点是普遍性突变，12（32%）个为异质性突变。属于驱动突变的有31个。此外，在肿瘤组织中，全外扩增测序（WES-AmpliSeq）和多重PCR高通量测序（mPCR-NGS），等位基因变异频率（VAFs）结果高度一致。

3.不同病人中分离得到的cfDNA含量在7.44-11.2ng之间，4个病人cfDNA测序结果中均发现了突变基因，共检查到了16个突变位点，不同病人检测到的突变位点数量不同，这与不同病人血浆中分离出的cfDNA含量高低相关。L012病人中有四个异质性突变基因，VAFs高于另外3个病人。预测增加血浆取样体积，可以提高mPCR-NGS的检测灵敏性，在VAFs低时也能够检测到突变基因。来源于正常捐献者的cfDNA中无突变检出。另外，在所有样本的cfDNA测序结果中，普遍性变异和异质性变异的VAFs如下图所示。

Comparison of VAFs for ubiquitous and heterogeneous mutations detected by mPCR-NGS in cfDNA from patients with non-small-cell lung cancer(NSCLC)

4.对cfDNA和肿瘤组织样本的VAFs进行线性化分析，发现两者存在显著的线性化关系（R2= 0.5144; P = 0.0018）。