响应面法优化黑木耳多糖的制备工艺研究
唐旋，唐王裔，何伟峰，王革，张拥军，朱丽云，王为民
（中国计量学院生命科学学院，浙江杭州310018）
摘要：针对黑木耳细胞壁异常坚韧的特点，探讨使其壁内多糖有效溶出的工艺方法。采用高压均质与酶法结
合的工艺，借助Minitab统计软件，利用中心组合试验法对黑木耳多糖的提取工艺进行优化。结果表明，黑木耳在均
质压力8~10MPa下均质10~12min进行破壁预处理后，采用0.05mol/L柠檬酸钠缓冲溶液作为溶剂，80℃下提取2
h，然后冷却至45℃，添加纤维素酶355U/g，在料液比1∶48、pH5.0的条件下提取1.2h，NaOH调至中性后迅速提高
温度至85℃灭酶1h，获得黑木耳多糖的得率达到15.37%。
关键词：黑木耳；多糖；高压均质；纤维素酶；中心组合试验
中图分类号：TQ929.2文献标识码：A文章编号：1004-874X（2014）03-0103-05
StudyonpreparationtechnologyoptimizationofAuricularia
auricularpolysaccharidebyresponsesurfacemethod
TANGXuan,TANGWang-yi,HEWei-feng,WANGGe,ZHANGYong-jun,ZHULi-yun,WANGWei-min
(CollegeofLifeSciences,ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,China)
Abstract:TheprocessofdissolvingAuriculariaauricularpolysaccharideouteffectivelyaccordingtothe
characteristicsofitsleatherycellwallwasstudied.Thisexperimentusedthecombinationofhighpressurehomogenization
andenzymemethod,andoptimizedtheextractionprocessofpolysaccharidesfromA.auriculabyusingcentralcomposite
designmethodwithMinitabstatisticalsoftware.Theresultsshowedthat,A.auricularwashomogenizedunder
homogenizationpressure8~10MPafor10~12minasbrokenpretreatment,then0.05mol/Lsodiumcitratebuffersolution
wasusedassolventtoextractfor2hat80℃.Coolingto45℃,355U/gcellulasewasaddedandthereactionlasted1.2h
intheliquidratioof1∶48inpH5.0.ThenweadjustedpHtoneutralwithNaOH,andquicklyraisedthetemperatureto
85℃,stayed1hforenzymeinactivation.Underaboveconditions,A.auriculapolysaccharidesyieldreached15.37%.
Keywords:Auriculariaauricular;polysaccharide;highpressurehomogenization;cellulose;centralcombination
testing
黑木耳Auriculariaauricula（L.exHook.）属于担子
菌纲木耳目木耳科木耳属，为我国珍贵的药用和食
用胶质真菌。我国是世界上生产黑木耳的主要国家，
产量占世界黑木耳总产量的90%左右。明代李时珍
撰写的《本草纲目》中，记载了黑木耳的多种药用功
效。现代医学研究也进一步证实了黑木耳多糖具有
抗肿瘤
[1-2]
、抗氧化
[3-4]
、降血糖
[5]
、降固醇
[6-7]
、抗血
栓
[8]
、抗辐射
[9]
、抗疲劳
[10]
以及增强免疫力
[11]
等生物学
活性。
与其他来源的材料相比，制备黑木耳多糖具有特
殊性，这是因为黑木耳菌丝的细胞壁异常坚韧，其细胞
壁主要成分为几丁质（一种乙酰葡萄糖胺的多聚体）及
小量的纤维素和称作葡聚糖的葡萄糖多聚体
[12]
。同时，
黑木耳是一种特殊的胶质体真菌，其碳水化合物含量
很高，随着黑木耳吸水溶胀后，可溶性部分从组织中流
出，增加了提取体系的粘度，给黑木耳多糖的提取制备
过程增加了难度。常见黑木耳多糖的水法提取工艺，其
多糖得率低且纯度不高；酸/碱/酸碱结合工艺虽然得率
较高，但会造成多糖成分降解且淀粉、蛋白不能完全去
除。酶法由于温和且无残留，是一种非常有前景的细胞
破壁技术，国内已有关于应用酶法提取黑木耳多糖的
研究，采用的酶主要是纤维素酶
[13-14]
、蛋白酶
[13]
、果胶
酶
[14-15]
等，这些酶只是破坏真菌中含量不多的相应的底
物，对黑木耳没有特异性，且破壁效果不明显。本研究
将物理高压均质法与生物酶法相结合，采用响应面法
优化黑木耳多糖的提取工艺，达到壁内多糖有效溶出
的效果。
收稿日期：2013-11-04
基金项目：国家自然科学基金（31371765）
作者简介：唐旋（1993-），女，在读本科生，E-mail：tangxuan
93@126.com
通讯作者：张拥军（1971-），女，博士，教授，E-mail：yjzhang
@vip.163.com
广东农业科学2014年第3期
103
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
OD
值
248121620
葡萄糖浓度（μg/mL）
图1黑木耳多糖标准曲线
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0200300400500
酶添加量（U/g）
图2纤维素酶添加量对黑木耳多糖提取的影响
多糖
得率
（
%
）
1材料与方法
1.1试验材料
供试菌床木耳（新科241）子实体购自浙江富来森
食品有限公司。苯酚、硫酸、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸、
95%乙醇、无水乙醇购自杭州米克化学仪器有限公司，
纤维素酶（10000U/g）购自江苏锐阳生物科技有限公
司。
试验仪器：AL04型电子天平（梅特勒-托利多有限
公司），JP-250A-I型高速多功能粉碎机（上海久品工贸
有限公司），T6新世纪分光光度仪（北京普析通用有限
公司），HH-2型水浴锅（江苏省金坛市恒丰仪器制造有
限公司），DL-5M离心机（配更换转头，购自湖南星科技科
学仪器有限公司），NanoGenizer高压均质机（苏州微流纳
米生物技术有限公司），搅拌器（江苏省金坛市恒丰仪器制
造有限公司），DHG-9240A型鼓风干燥箱（上海一恒科技
有限公司）。
1.2试验方法
1.2.1黑木耳预处理取过125μm筛的黑木耳粉10g，按料
液比1∶15（g/mL）加入0.05mol/L柠檬酸钠缓冲溶液充分
溶胀后，在高压均质机均质压力8~10MPa条件下均质
10~12min，使黑木耳有效破壁。
1.2.2黑木耳多糖的纤维素酶法提取单因素试验取高压均
质机均质后的黑木耳浆料，加入0.05mol/L柠檬酸钠缓冲
溶液50mL，在80℃水浴锅搅拌（120r/min）的条件下提取
2h，冷却至45℃，加入纤维素酶按以下方法进行提取。
（1）纤维素酶添加量对黑木耳多糖提取得率的影
响。补加柠檬酸钠缓冲溶液使料液比达到1∶100（g/mL），
调pH为5.0，依次按以下添加量加入纤维素酶：200、
300、400、500U/g，然后在45℃下提取1.5h，NaOH调
至中性后迅速提高温度到85℃灭酶1h，8000r/min离
心20min，取上清液，1∶4（V/V）95%乙醇醇沉，4℃静置
过夜，离心，取沉淀，溶解定容，待测。
（2）提取时间对黑木耳多糖提取得率的影响。在料
液比1∶100（g/mL）、加酶量300U/g的条件下，分别在
45℃下提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，NaOH调至中性后
迅速提高温度到85℃灭酶1h，8000r/min离心20
min，取上清液，1∶4（V/V）95%乙醇醇沉，4℃静置过夜，
离心，取沉淀，溶解定容，待测。
（3）料液比对黑木耳多糖提取得率的影响。在加酶
量300U/g，料液比分别为1∶12、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100
（g/mL）条件下提取1.5h，NaOH调至中性后迅速提高
温度到85℃灭酶1h，8000r/min离心20min，取上清
液，1∶4（V/V）95%乙醇醇沉，4℃静置过夜，离心，取沉
淀，溶解定容，待测。
1.2.3黑木耳多糖溶出量的计算采用改进后的苯
酚-硫酸法测定黑木耳多糖含量，按下式计算黑木耳多
糖提取得率。
多糖得率（%）=
C×V×N×10
－3
v×M
×100
式中，C为经过稀释后测定的多糖含量（μg），V为提取
后得到的上清液体积（mL），N为稀释倍数，v为用于测
定的上清液体积（mL），M为黑木耳子实体质量（mg）。
2结果与分析
2.1黑木耳多糖标准曲线
由图1黑木耳多糖标准曲线可得，多糖含量（μg/mL）
=（OD
490
+0.0006）/0.0218，R
2
=0.9951。
2.2各单因素对黑木耳多糖提取的影响
2.2.1纤维素酶添加量对多糖提取的影响纤维素酶
添加量对多糖提取的影响如图2所示。在固定料液比
1∶100、温度45℃、pH5的条件下酶解1.5h，多糖得率
随着酶用量的增加而增大，当酶用量达到400U/g时，
黑木耳多糖的提取得率最大。再增加酶用量时，多糖得
率出现下降趋势，这可能是由于底物浓度一定的情况
下，酶分子达到了饱和。
2.2.2提取时间对黑木耳多糖提取的影响在固定料
液比1:100、温度45℃、pH5.0、纤维素酶添加量300
104
多糖得率（%）
12.75
14.79
12.54
12.97
15.17
15.14
8.68
13.86
10.03
13.17
13.68
12.57
15.17
15.11
9.93
10.29
15.17
9.63
11.09
15.13
时间（h）
0
0
0
-1.682
-1
0
-1
-1
1
1
0
1
0
0
0
-1
0
1
1.682
0
酶添加量（U/g）
0
0
-1.682
0
-1
0
-1
1
-1
1
1.682
-1
0
0
0
1
0
1
0
0
料水比（g/mL）
1.682
0
0
0
1
0
-1
1
1
-1
0
-1
0
0
-1.682
-1
0
1
0
0
表2响应面试验方案及结果
料液比
23.18∶1
30∶1
40∶1
50∶1
56.82∶1
时间（h）
0.66
1.00
1.50
2.00
2.34
酶添加量（U/g）
231.82
300
400
500
568.18
水平
-1.68
-1
0
1
1.68
表1响应面试验因素与水平
14
13
12
11
10
9
8
7
6
多
糖
得
率
（
%
）
0.51.01.52.02.5
酶作用时间（h）
图3提取时间对黑木耳多糖提取的影响
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
多
糖
得
率
（
%
）
1∶201∶401∶601∶801∶100
料液比
图4料液比对黑木耳多糖提取的影响
U/g的条件下，提取时间对黑木耳多糖提取得率的影响
如图2所示。0~1.5h，随着提取时间的延长，溶液中可
溶性多糖的含量逐渐增加，细胞内多糖被释放出来；提
取时间超过1.5h后，溶液中多糖含量呈现递减的趋
势，这可能是因为随着酶解时间的延长，酶的稳定性受
到影响，也可能是溶出的可溶性多糖由于酶的作用降
解造成。因此，酶法提取多糖需控制酶解时间，避免造
成多糖损失。
2.2.3料液比对黑木耳多糖提取的影响在固定提取
温度45℃、提取时间1.5h、pH5.0、纤维素酶添加量
300U/g的条件下，料液比对黑木耳多糖提取得率的影
响如图4所示。料液比未达到1∶40时，多糖得率随着料
液比的增加而增加，料水比增加到1∶40后，多糖得率不
再继续提高，再增加溶剂剂量多糖的得率反而降低，这
可能因为随着提取溶剂的增加，一定程度稀释了多糖
的浓度，不利于多糖的沉淀。
2.3黑木耳多糖提取的中心组合试验设计和响应面分析
根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，将
纤维素酶添加量、酶作用时间和料水比3个因素作为
试验因素，参考单因素试验结果，以多糖得率为响应值
设计试验，试验因素及水平见表1，试验设计及结果见
表2。
采用Desigh-Expert软件对所得试验数据进行多元
回归拟合，以料液比（A）、纤维素酶添加量（B）、提取时
间（C）3个因子作为影响因素进行试验。由统计软件得
到的回归方程：
Y=15.09+0.64×A+0.18×B-0.42×C-1.39×A
2
-0.76×
B
2
-1.15×C
2
-0.49×A×B-2.02×A×C-0.013×B×C
回归方程系数分析结果见表3。由表3分析可得，
除单因子B、交叉项BC不显著外，其他参数拟合均显
著，且模型R
2
=0.9815，说明该数学模型的拟合效果较
好。
响应面图形是响应值对各试验因子A、B、C构成
的一个三维空间的曲面图，从响应面的三维分析图中
可以找出最佳参数及各参数之间的相互作用。以Y轴
为响应值，每次对其中两个因素做响应面图如图5~图
7所示。
应用Desigh-Expert软件对其进行响应面优化，得
到结果：A=0.83，B=-0.45，C=-0.59。代入前述变换公式
105
15.5547
14.2362
12.9178
11.5993
0.2809
500
450
400
350
30030
35
40
45
50
A：料液比
B:酶添加量
500
450
400
350
300
3035404550
A：料液比
B
:
酶
添
加
量
图5料液比与纤维素酶添加量对多糖得率影响的响应面
15.5547
14.2362
12.9178
11.5993
10.02809
2.00
1.75
1.50
1.25
1.00
C：时间
50
45
40
35
30
A：料液比
2.00
1.75
1.50
1.25
1.00
C
：
时
间
3035404550
A：料液比
图6料液比与提取时间对多糖得率影响的响应面
显著性
显著
不显著
显著
显著
显著
显著
显著
显著
不显著
P值
0.0002
0.1426
0.0035
<0.0001
<0.0001
<0.0001
0.0071
<0.0001
0.9332
F值
32.97
2.53
14.39
164.54
49.68
111.82
11.37
192.71
7.398E-3
均方差
5.57
0.43
2.43
27.80
8.39
18.89
1.92
32.56
1.25E-3
自由度
1
1
1
1
1
1
1
1
1
参数
A
B
C
A
2
B
2
C
2
AB
AC
BC
表3方差分析结果
得到最佳提取工艺为：料液比48∶1、纤维素酶添加量
355.0U/g、提取时间1.2h，此时黑木耳多糖得率Y=
15.45%。以最佳组合方案的提取条件进行验证试验重
复3次，得到黑木耳多糖实际得率平均值为15.37%，
近似理论值。
3结论与讨论
黑木耳的细胞壁异常坚韧，常规提取方法很难有
效破壁；且其内含较高的碳水化合物，随着黑木耳的吸
水溶胀，可溶性部分从组织中流出，增加了提取体系的
粘度，给黑木耳多糖的提取制备过程增加了难度。本研
究将物理高压均质法与生物酶法相结合，从多糖提取
试验条件及其结果可以看出，高压均质后，采用纤维素
酶（400U/g）法可以将黑木耳多糖的得率从7.05%提高
至14.81%。进一步采用响应面法优化黑木耳多糖的提
取工艺，结果表明最佳提取工艺为：黑木耳粉按料液比
1∶15（g/mL）加入柠檬酸钠缓冲溶液充分溶胀后，在高压
均质机的均质压力8~10MPa下均质10~12min，再加
入柠檬酸钠缓冲溶液50mL，在80℃水浴锅搅拌条件
下提取2h，冷却至45℃后，添加纤维素酶355U/g，在
料液比48∶1、pH5.0的条件下提取1.2h，NaOH调至中
性后迅速提高温度到85℃灭酶1h，此时获得黑木耳多
糖得率为15.37%。下一步将在获得黑木耳多糖提取工
106
15.5547
14.2362
12.9178
11.5553
10.2809
2.00
1.75
1.50
1.25
1.00300
350
400
450
500
B:酶添加量
C：时间
2.00
1.75
1.50
1.25
1.00
C
：
时
间
300350400450500
B:酶添加量
图7纤维素酶添加量与提取时间对多糖得率影响的响应面
艺的最优化基础上，进一步研究黑木耳多糖的分子组
成、分子结构以及其降血糖的功能活性与机制。
参考文献：
[1]黄滨南,张秀娟,邹翔,等.黑木耳多糖抗肿瘤作用的研究[J].
哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2004,20(6):648-651.
[2]MaZC,WangJG,ZhangLN,etal.Evaluationofwater
solubleβ-D-glucanfromAuriculariaauricular-judaeas
potentialanti-tumoragent[J].CarbohydratePolymers,2010,
80:977-983.
[3]史亚丽,姜川,杨立红,等.黑木耳粗多糖对力竭小鼠抗氧化
能力的影响[J].现代预防医学,2008,35(24):4845-4847.
[4]田志杰,吕世杰,姜艳霞,等.正交法提取木耳多糖及对大鼠
血清超氧化物歧化酶和体外肝脏脂质过氧化的影响[J].时
珍国医国药,2009,20(11):2694-2695.
[5]韩春然,马永强,唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用[J].
食品与生物技术学报,2006,25(5):111-114.
[6]CheungPCK.Thehypocholesterolemiceffectoftwoedible
mushrooms:Auriculariaauricular(Tree-ear)andTremella
fuciformis(Whitejelly-leaf)inhypercholesterolemicrats[J].
NutritionResearch,1996,16:1721-1725.
[7]杨春瑜,姜启兴,夏文水,等.黑木耳超微粉多糖相对分子质
量分布及降血脂功能研究[J].中国食品学报,2008,8(6):23-
32.
[8]樊一桥,武谦虎,盛健惠.黑木耳多糖抗血栓作用的研究[J].
中国生化药物杂志,2009,30(6):410-412.
[9]樊黎生,龚晨睿,张声华.黑木耳多糖抗辐射效应的动物实
验[J].营养学报,2005,27(6):525-526.
[10]朱磊,王振宇.黑木耳多糖对小鼠抗疲劳作用的研究[J].营养
学报,2008,30(4):430-432.
[11]张会新,刘洪雨,刘畅,等.黑木耳多糖对小鼠免疫功能的影
响[J].动物医学进展,2009,30(7):23-25.
[12]IE阿喀莫著，林雅兰译.微生物学[M].北京：科学出版社
2002.
[13]王金凤.木耳多糖提取工艺研究[J].食品科学,2004,25(6):143-
146.
[14]张立娟,于国萍.细胞破壁酶在黑木耳多糖提取中作用条件
的研究[J].食用菌,2005(3):8-10.
[15]姜红,孙宏鑫,李晶.酶法提取黑木耳多糖[J].食品与发酵工
业,2005,31(6):131-133.
（责任编辑刘翀）
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