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OneShine™CRISPR/Cas9基因过表达细胞文库 一、原理   此系统包括lentiSAMv2质粒和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒。lentiSAMv2质粒如图一所示，其中，eSpcas9(1.1)也叫做dCas9，是将Cas9酶切位点突变后形成的，它只具有结合基因组和sgRNA的能力，而不具备切割DNA的能力。lentiSAMv2质粒的sgRNA经过改造，在sgRNA后面加入了19个碱基（MS2 binding site）。这19个碱基经过转录后形成一个具有茎环结构的RNA，此RNA能特异性地与MS2蛋白结合。而在另一个载体lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒上，MS2蛋白已经与P65、HSF1蛋白融合。其中，P65、HSF1是两个转录因子。因此，当两个载体同时进入同一个细胞后，lentiSAMv2质粒表达“sgRNA- MS2 binding site“融合RNA及dCas9蛋白，lenti MS2-P65-HSF1_Hygro载体表达MS2-P65-HSF1融合蛋白。在dCas9作用下，则形成“基因组DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2- P65-HSF1”这一超级复合体。当sgRNA为转录起始位点时，此超级复合体定位于转录起始位点，由于P65、HSF1可以募集更多转录因子，因此可启动转录，从而激活转录起始位点后面的基因表达。 我们合成了7万多个转录起始位点的sgRNA（对应2万多个基因），分别载入lentiSAMv2质粒中，再把此7万多个质粒混合起来，形成文库。并将此文库整合到了细胞中，一个125cm²细胞培养瓶中含有约10^8个细胞，每个细胞被激活一个基因，共约2万个基因被激活，所以含有每个特定激活基因的细胞约有5000个（10^8/2万）。 二、参数 靶基因物种：人 靶基因数目：23,430 gRNA数目：70,290 细胞类型：胃癌、乳腺癌、结肠癌等癌细胞系和永生化的细胞系。 价格：7万元/株 三、应用 【应用举例：细胞凋亡相关基因筛选】 取细胞文库进行扩增，然后平均分成两份，每一份包含10^8个细胞，每个细胞被激活了一个基因，共约2万个基因被激活，所以含有每个特定激活基因的细胞约有5000个（10^8/2万）。向其中一份细胞中加入放线菌素D、诱导细胞凋亡（A组），在另一份细胞中加入溶剂、作为对照（B组）。A组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞A1、未凋亡细胞A2。B组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞B1、未凋亡细胞B2。分别对A1、A2、B1、B2进行短测序，检测哪些基因被激活了。A2中被激活的细胞即为能抵抗凋亡的基因，B1中被激活的基因即为能诱导凋亡的基因。其它应用： （1）新药靶点确定与验证； （2）环状RNA上游调控机制分析、下游调控机理分析 （3）Long noncoding RNA作用机制验证； （4）脂肪代谢机制研究； （5）干细胞自我更新、不对称性分裂机制等。 |
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