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【GenePilot】脑脊液ctDNA检测在中枢神经系统领域的应用案例——原发性脑肿瘤

 a我爱医学 2017-09-12



中枢神经系统(CNS)恶性肿瘤常规的检测方法包括X射线断层成像和MRI等影像技术,但因其非特异性很难用于治疗效果和肿瘤进展等方面的监测和评估。近年来从肿瘤细胞释放的cfDNA已被证实可作为肿瘤特异性的生物标志物,用于辅助精准诊疗,然而由于血-脑屏障的存在,使其很难在脑肿瘤中被检测到,而大脑具有自己的体液回路——脑脊液(Cerebro-Spinal Fluid, CSF)作为中枢神经系统特有的循环液体,充满于脑室和脊髓中,可与病灶处肿瘤细胞直接接触,成为脑肿瘤液体活检的突破点。本期小编将与大家分享两篇利用脑脊液进行原发性脑肿瘤突变检测的经典案例。

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Detection of tumor-derived DNA in cerebrospinal fluid of patients with primary tumors of the brain and spinal cord

原发性脑肿瘤进行脑脊液ctDNA的检测[1]


研究基础

脑肿瘤的液体活检借鉴于其他癌种解剖学相关的液体检测[2],研究人员猜测是否可以在中枢神经系统的脑脊液中检测到一定水平的ctDNA?本实验主要目的有:1.能否在原发性CNS肿瘤中检测到CSF-ctDNA;2. 结合肿瘤的解剖学和病理学特征进行CSF-ctDNA的检出分析。


实验设计

本次研究分析了35例CNS肿瘤病例,包括6例髓母细胞瘤和29例脑胶质瘤。手术中获取脑脊液、血液和肿瘤组织(肿瘤细胞占比超过50%)。采用分层递进的方法进行突变检测,首先利用PCR技术对全部肿瘤组织样品检测特定基因(IDH2、TP53、TRET、IDH1)的突变情况(13例有突变),其中无突变的样品(22例)再采用全外显子测序(WES)进行检测;肿瘤组织测序检测到突变时,则对同一病人的CSF-ctDNA进行验证检测。


研究结果

1. 体细胞突变检测

目标区域测序鉴定了13例肿瘤组织,突变分别出现在TP53 (n = 5), IDH1 (n =2), TERT 启动子区 (n = 6)。剩余22例肿瘤组织采用WES,每例最少被检测到1个突变,包括NF2, PIK3R1, PTCH1 , PTEN等驱动基因的相关突变。肿瘤组织中检测到突变后,即在同一病人的脑脊液中进行35个突变位点的检测,发现35例病人中74%可检测到ctDNA(表1)。CSF中检测的等位基因突变频率低于原发肿瘤组织,而且变异幅度更大,平均为12.2%(0.1-77%)。

表1. 患者的肿瘤组织和脑脊液对应突变检测



2. 脑脊液中ctDNA检测与临床病理学特征的关系

脑脊液中ctDNA的检出结果与患者的临床特征、是否存在脑积水、影像对比增强、突变类型、脑肿瘤大小等因素均没有相关性(表2)。相关性因素为肿瘤的病理分级,高级别肿瘤(WHO分级为III 、 IV级)比低级别肿瘤更容易检测到CSF-ctDNA(P = 0.004)。CSF-ctDNA等位基因突变在高低级别肿瘤的分布分别为16.3 ± 21.2% , 2.8 ± 6.8%。高级别肿瘤中CSF-ctDNA的检出率为95%(18/19)。

另一个影响CSF-ctDNA检测水平的重要因素为肿瘤组织位置,MRI可显示CSF与肿瘤组织的位置关系,图1为典型实例。患者的肿瘤组织如果直接与脑脊液腔接触,将更容易(位于皮质表层、脑室、基底等)检测到CSF-ctDNA。86%(24/28)的肿瘤组织与脑脊液腔临近的患者可检测到CSF-ctDNA,这其中包括13例高级别胶质瘤,3例室管膜瘤,5例髓母细胞瘤患者。4例没检测到CSF-ctDNA的为低级别胶质瘤患者。此外,还有5例被脑和脊髓实质完全包裹的肿瘤组织样,在脑脊液中都没有检测到ctDNA (P < 0.001) (表1)。


表2. 临床特征与CSF-ctDNA检出相关性



图1. CSF-ctDNA检出率与脑脊液室的位置关系

注:A:肿瘤组织(红色箭头)与脑脊液室位置相邻;

           B:肿瘤组织(红色箭头)与脑脊液室位置不相邻。



结论点评

本研究中CSF-ctDNA的检出率为74%,与其他类型肿瘤中液体活检的检出率相近[2]。大多数原发性脑肿瘤会释放ctDNA到CSF中,目前通过开颅手术方式获取到的脑脊液样品,可用于鉴定CSF-ctDNA的基础水平;而通过腰穿方式获取的脑脊液样品则可将随着诊疗的进程CSF-ctDNA突变检测水平变化作为纵向研究,用来作为临床分子生物标志物,进行临床疗效评估、肿瘤复发动态监控。



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Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma

脑脊液ctDNA检测比血浆更好地反馈脑肿瘤中基因组的变化[3]

研究基础

相关研究表明脑肿瘤患者的脑脊液中含有一定水平的ctDNA[4] 。本研究的目的是确定CSF-ctDNA的检测与血浆中ctDNA相比是否更适用于脑肿瘤的鉴定与监测。


实验设计

  • 入组患者:4例恶性胶质母细胞瘤患者(GBM,glioblastoma);

  • 检测样本:脑部原发灶组织、脑脊液、血浆;

  • 测序方法:全外显子测序(脑肿瘤组织),平均测序深度260×;靶向捕获(脑脊液、血浆)341个基因的外显子, NGS测序 ;

  • 验证方法:微滴式数字PCR(ddPCR)技术(血浆和脑脊液)。


研究结果

1. 相比于血浆ctDNA,CSF-ctDNA能更好的反应脑肿瘤的突变特征

针对4例胶质母细胞瘤患者(GBM,glioblastoma)血浆中的ctDNA和脑脊液中的ctDNA进行目标区域捕获测序,检测SNV、InDel和CNV三种变异形式,并在肿瘤组织中进行相关的验证。结果表明:在4个脑肿瘤样本中,CSF-ctDNA检测出的突变位点显著多于血浆中检测出的ctDNA的突变(图2),CSF-ctDNA能够检测到在血浆中不存在或者频率较低的突变(突变检测灵敏度为2%)(图3)。


图2. CSF-ctDNA比血浆中ctDNA更好的反馈肿瘤基因的变异情况


图3.CSF-ctDNA与血浆ctDNA检测灵敏性对比


2. CSF-ctDNA用于脑肿瘤治疗疗效的全病程监测

文章针对CSF中存在的ctDNA的含量是否随时间变化而波动进行相关研究。针对脑肿瘤组织中测出的基因突变,利用ddPCR对CSF-ctDNA进行监测,并利用MRI进行脑肿瘤的影像学验证。

结果表明:CSF-ctDNA的基因突变频率会随着治疗的(手术和系统治疗)进行而降低,也会随着肿瘤复发或者进展而升高,从而说明CSF-ctDNA基因突变频率会随着肿瘤负荷的改变而改变(图4),并且其变化趋势与MRI反应的肿瘤负荷变化趋势一致;说明CSF-ctDNA在脑肿瘤治疗疗效的全病程监测中是一个有效的分子生物标志物。


图4. 脑肿瘤CSF-ctDNA进行病人病程诊疗动态监控


结论点评

与血浆ctDNA相比,在中枢神经系统疾病中CSF-ctDNA具有更好的代表性和更高的灵敏度;GBM患者术后复发率较高,且复发后的病灶常常由于治疗呈现出与术前组织不同的突变频谱,利用CSF-ctDNA可以进行全病程的监测与管理,可以反映患者的病情进展或者复发情况。


小结

脑脊液ctDNA检测作为一种微创的液体活检检测手段,在应用上具有独特优势:

  • 其将为无法通过开颅手术或其它原因提供肿瘤组织的初诊患者提供分子分型、预后判断、制定诊疗方案等参考信息;

  • 同时脑脊液ctDNA检测可作为临床纵向研究的生物标志物,将为原发性脑肿瘤的全病程监控产生重要影响。


下期将跟大家分享脑脊液ctDNA在比原发性脑肿瘤发病群体更大、病理更复杂的脑转移瘤中的应用案例。


参考文献

[1] Yuxuan W,et al.(2015) Detection of tumor-derived DNA in cerebrospinal fluid of patients with primary tumors of the brain and spinal cord. PNAS 112(31):9704-9.

[2] Allory Y, et al. (2014) Telomerase reverse transcriptase promoter mutations in bladder cancer: High frequency across stages, detection in urine, and lack of association with outcome. Eur Urol 65(2):360–366.

[3] LD Mattos-Arruda, et al. (2015) Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature Communications 6: 8839.

[4] Bettegowda, C. et al. (2014) Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, 224ra24.


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