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基因农业网编译（译：Panda，校：刘杰）：植物病理学家珍·瑞斯达里诺（Jean Ristaino）在世界各地追踪那些威胁作物健康的各种致病菌。去年，她花了整整两个月时间走访了印度、乌干达和台湾，帮助那里的同行们追踪一种名叫块茎作物晚疫病菌（Phytophthora infestans）的真菌，它能感染西红柿和马铃薯并且还是导致了19世纪欧洲大饥荒的罪魁祸首。瑞斯达里诺通过农民在线上传的晚疫病发病情况来追踪这种病原菌在近期的传播模式，随后，她亲自去这些地方收集真菌样本。在位于罗利市的北卡罗来纳州立大学的实验室里，瑞斯达里诺的研究小组对各处农场采集来的真菌样本进行基因分型鉴定，以此来追溯其发源地并搞清楚这种晚疫病菌的基因组在应对杀菌剂时所发生的变化，以及它们如何破坏宿主植物用以自我防御的免疫系统。 与动物一样，植物也必须与那些不断寻找健康细胞并以之为食的病原菌作斗争。但与动物不同的是：植物并没有可移动的免疫细胞巡视周身以发现“入侵者”。“每一个（植物）细胞都必须又是免疫细胞”杰夫·唐格尔（Jeff Dangl）说到。他在位于教堂山的北卡罗来纳大学研究植物与微生物的相互作用。 在模式植物拟南芥进行的几十年研究已经初步揭示了植物细胞内的免疫通路。首先，定位于细胞膜上的受体识别少数病原菌，触发信号级联反应，进而改变激素水平和免疫基因的表达。随后促使细胞加强细胞壁水平的防护，并释放出活性氧类和非特异性的抗菌化合物来抵御入侵者。这一系列反应还能通过二级免疫通路不断持续和放大，最终导致局部植物细胞死亡。某些植物产生的防御性化合物甚至可以影响细菌之间的联系。比如，最近有研究发现，多酚迷迭香酸可扰乱绿脓假单胞菌（Psuedomonas aeriginosa）用于形成菌膜的群体感应系统。 不过，上述通路和其他一些免疫通路在分子水平上的工作细节还有待阐释清楚，“机理尚不明确”，位于英国诺威奇市的塞恩斯伯里实验室的植物免疫学家乔纳森·琼斯（Jonathan Jones）说。 科学家们现在正在填补他们对植物免疫系统的认知缺口，并发现了一些因子，如微生物群落的组成和生物周期节律，在这个系统中所扮演的之前未料想到的重要角色。如果他们能够理解植物的防御方式，或许他们可以通过引入在现代品种育成过程中被忽视的免疫基因来获得更加抗病的作物品种。一些研究者还将目光投向改变已知的免疫受体以使植物能够无视那些到处乱窜的病原菌对植物免疫“雷达”的适应性而能够快速识别病原菌。总之，这些策略能够帮助植物育种家们紧跟上导致经济灾难的病原菌的变异步伐，比如作物晚疫病菌。 组合拳法连环出击 植物的第一道防线是识别病原菌相关分子模式（PAMP），PAMP可在如鞭毛蛋白的蛋白质中找到，也可在革兰氏阴性菌细胞膜外部的脂多糖类或是真菌细胞壁上的复合糖中找到。细胞表面的模式识别受体（PRR）与PAMP结合，激活非特异性抗菌化合物（比如类黄酮和生物碱类）以及包括蛋白酶和脂酶在内的多种生物酶类的合成。不过，PAMP响应并不总是按预期进行，唐格尔说，“病原菌会学习利用各种方法破坏……植物的防御系统。” 通过直接向植物细胞质中注入所谓的“效应物”蛋白，细菌和真菌类的病原菌能够干扰PRRs的下游信号级联反应，或直接作用于激素调节通路和转录因子，以阻止PAMP触发免疫反应。这个时候，植物的第二道防线就要开始工作了。细胞借助于其他受体感应细菌效应物，由这类被称为胞间核苷酸结合域、富含亮氨酸重复序列受体（NLR）来触发二级免疫级联反应。 NLR在植物免疫系统中具有很大的灵活性。拟南芥只有150种NLR蛋白——其数量远不足以与植物体可能遭遇的病原菌效应物类型相匹配。不过，NLR不仅能识别病原菌效应物；许多NLR还能识别这些效应物在植物体内的靶标蛋白。比如，丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）产生的蛋白酶可降解植物体内一种名为RIN4的蛋白，这种蛋白质可在PAMP引发的免疫反应中起作用。RIN4与一种名为RPS2的NLR结合，因此，当细菌蛋白酶导致植物体内RIN4蛋白水平降低时，RPS2发现蛋白缺失，由此启动报警信号。“一旦宿主弄清楚如何识别你的行为，你的蛋白酶功能就没有什么用处了，”唐格尔说。通过识别受损蛋白的“自我修复”状态，NLR能够检测到许多作用于同一个宿主靶标的效应物的存在情况。 在过去的十年中，研究人员找到了几个NLR成对运行的实例：其中一个与病原菌效应物结合，另一个介导下游信号传导。比如在拟南芥中，NLR RRS1和RPS4一起发挥作用，感知来源于几病原菌的效应物：RRS1与它们结合，而RPS4激活机体的防御反应。RRS1含有一个结构域，看起来很像是WRKY转录因子蛋白家庭成员——这是一类植物中的主要免疫基因调节蛋白，它们是几类细菌效应物的作用靶标。随后的研究发现，这种现象很常见，即成对出现的NLR中总有一个成员带有从某个效应物靶标蛋白那儿借来的相似结构域。某些研究者据此提出假设，这些额外的相似结构域可能是诱饵：效应物与NLR结合，在它造成过多伤害之前向植物免疫系统发出病原菌入侵的警告。果然，研究发现一种名为PopP2的细菌效应物能够将WRKY乙酰化，这种效应物同样也能将RRS1中的WRKY结构域乙酰化，以激活RPS4介导的免疫反应。 琼斯说，诱饵NLR能够提供有用的快捷方式来分辨那些与免疫受体和防御基因激活相关的信号蛋白。任何与NLR融合的诱饵结构域都有可能是病原菌效应物的作用靶标，因此很有可能参与植物的免疫反应。 将植物的免疫基因进行分类，并了解它们的工作原理，这对于作物育种和基因工程改造来说是十分关键的，而这些技术能帮助我们应对快速突变进化的病原菌。尽管现在有许多转基因作物的贸易和消费十分广泛，但是绝大多数的种植者所使用的杀虫剂还是化学杀虫剂。在美国，仅仅为对抗晚疫病，农民每年就花费高达7710万美元用于购买杀真菌剂。这些杀虫方法对发展中国家的农民来说过于昂贵，因此研究人员期望用遗传的手段来增强植物的防御系统。“宿主植物的自主防御可能是减少损失最有效的方法”，瑞斯达里诺说到。 植物免疫的实际应用 抗击晚疫病：这是一种卵菌纲真菌，可致番茄和土豆晚疫病，美国农民每年为此付出数千万美元的代价。图片来源：© NIGEL CATTLIN/SCIENCE SOURCE 在农业生产中应用植物免疫通路相关知识最为直接的方法是向植物中引入自身的免疫基因。许多驯化作物的野生近缘种仍然带有这些“抗性（R）”基因，能够保护植物不受特定病原菌的侵害。一旦找到这些基因，研究人员就能或通过杂交或是转基因的方法将它们引入当今我们食用的蔬果和谷物作物的基因组中去。 最早通过育种技术引入作物中的抗性基因可编码一种名为R3a的NLR，这一抗性基因来自于马铃薯的野生近缘种Solanum demissum。在20世纪早期，研究人员发现这种野生的马铃薯对晚疫病有抗性，因此开始尝试将它与栽培马铃薯品种进行杂交，以将抗性基因转移到栽培作物中。 R3a蛋白可识别晚疫病菌的效应物AVR3a，但由于R3a被引入了栽培马铃薯中，另一种可逃避R3a检测的真菌变体开始引发新的疫情。为解决这一难题，塞恩斯伯里实验室的索非恩·卡蒙（Sophien Kamoun）期望能够改变R3a，以使它能够与一种神秘的效应物AVR3aEM结合。2014年，他的研究小组使用随机突变的方法制造出一系列单个氨基酸突变的R3a变体，并鉴定得到了几个能使NLR识别AVR3aEM的变体蛋白。研究人员还发现，其中一个突变的受体还能与来自于另一种真菌病原菌的效应物结合。“这个概念非常酷！它开启了利用基因工程进行受体合成的全新世界。”卡蒙如是说。 对NLR进行基因工程修饰以扩展其感应效应物的范围，这可能是有效提高对多种病原菌抗性的一劳永逸的方法。最近，卡蒙和同事们利用他们在随机突变R3a编码基因时积累的经验，选择性地突变一种名为I2的番茄NLR同源基因。他们增强了I2对晚疫病以及一种可导致番茄枯萎的真菌效应物的感知灵敏度。突变体I2在模式植物烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中的表达可有效保护植物叶片不受晚疫病菌的感染。 通过识别受损蛋白的“自我修复”状态，NLR能够检测到许多作用于同一个宿主靶标的效应物的存在情况。 研究人员对受体进行突变以提高对病原菌的抗性，NLR并不是唯一的突变目标，他们还对效应物靶标进行基因工程改造。去年秋天，密歇根州立大学植物学科学家何胜阳和他的研究团队报道了一例对名为COI1（对冠菌素不敏感）植物激素受体进行单个氨基酸突变后可保护拟南芥不受丁香假单胞菌感染的案例。当植物激素茉莉酸与COI1受体结合后，它激活植物体对取食昆虫的防御通路，但却以降低对丁香假单胞菌免疫响应为代价。致番茄叶斑病的丁香假单胞菌可产生一种茉莉酸的类似物，名为冠菌素，它与COI1结合后使植物的抗菌免疫反应处于被抑制的状态。不过，当研究人员向COI1中引入一个氨基酸的突变后，它就不再与冠菌素结合，只保存正常的与茉莉酸结合的能力，因而使植株对丁香假单胞菌产生抵抗力，而无需破坏植物中依赖于茉莉酸的抗取食昆虫防御系统。 植物如何击退病原菌的入侵：植物具有两条基本的免疫通路。首先，植物细胞膜上的模式识别受体（PRR）识别由入侵者释放出的病原菌相关分子模式（PAMP），并触发细胞内的信号通路，促使活性氧类（ROS）和抗菌化合物的合成并改变基因表达和激素水平。随后，植物细胞间名为核苷酸结合域、富含亮氨酸重复序列受体（NLR）的蛋白质复合体与效应物结合，启动二级免疫级联反应，将PAMP触发的免疫反应放大。NLR的结合还能导致植物细胞死亡，限制病原菌感染的扩散范围。图片来源：© THOM GRAVES 何教授通过突变宿主靶标让植物增强对病原菌攻击的抵抗力的方法绕过了新型抗性基因育种中的主要障碍。“总是存在着利与弊的权衡，”位于德国科隆的马克斯普朗克植物育种研究院的植物免疫学家伊姆勒·索姆斯奇（Imre Somssich）说，“如果抗性基因处于永久激活状态，那么植物个体就会非常小。”而让植物不受细菌侵害避免了免疫监控升级的麻烦，在不影响生长的前提下提供有效的植物保护方案。 不过，要想在植物生长和免疫增强之间真正达到平衡，科学家们仍需知道更多关于调节这些反应的细胞通路是如何相互关联的。英国华威大学研究植物免疫的帕特里克·舍费尔（Patrick Schäfer）正在研究由细菌鞭毛蛋白激活的免疫反应如何影响拟南芥根部细胞的细胞周期。他说，现阶段的研究结果表明，内分泌系统似乎是植物生长与其对病原菌的抗性之间最强的联结点。舍费尔说：“看起来像是免疫反应所使用的激素调节通路同时也参与了植物生长的信号通路。” 最近，由杜克大学的植物学家董欣年带领的研究团队提出了另一种植物兼顾防御和生长的方式：通过使用内在生物钟。2011年，他们意外地在拟南芥中发现了免疫基因表达与内在生物节律之间的相关性。“那时候我们都感到不解，”她说，“我们以为这些基因不过是由病原菌诱导产生的，但随后，我们发现了它与生物钟之间的关联。” 植物免疫系统之间的权衡：植物免疫系统必须综合考虑多种因素以成功抵御病原菌而不伤害作物自身。比如，与防御相关的激素信号变化可能会干扰植物生长。许多物种在夜间降低其免疫防御级别，全力保证快速生长。此外，植物免疫还随温度、湿度以及光照条件等波动，很有可能是由植物的地上和地下微生物群来决定的。图片来源：© ISTOCK.COM/OKEA/TULPAHN 董教授带领的研究小组发现了一个中枢生物钟转录因子，名为CCA1（生物节律相关蛋白），它每天早上第一件事就是激活抗性基因，参与抵御活体营养型卵菌（Hyaloperonospora arabidopsidis）的侵害；而此时正是这种真菌通常释放活力孢子的时候。去年，该研究小组报道了植物的氧化还原反应生物钟，它是由植物细胞代谢和激素水平调控的，与生物节律钟一起发挥作用，在早晨增强植物体的免疫力，而当傍晚植物进入旺盛生长期时，复又抑制植物体的免疫力。研究人员在黑暗条件下通过人为诱导植物体免疫来扰乱其内在生物节律，连续几个晚上过后，植物逐渐枯萎并死亡。 这一发现可能对那些利用激素水杨酸来刺激植物免疫的农民有所帮助，董教授说，“如果你在一天中的错误时间引入免疫反应，或许只能导致更多伤害。” 植物对病原菌抵抗力的另一个重要因素是微生物群落。何教授的研究小组已经发现，无菌培养的拟南芥植物体内许多免疫基因的表达水平较低，并表现出免疫应答障碍，比如活性氧类的产生，与其有菌对照相比。何教授希望今年能发表这些发现。唐格尔的研究小组最近也报道了拟南芥的微生物群落被植物的激素所改变的现象，特别是水杨酸。 但是，这些微生物群落如何与植物免疫系统相互作用仍然是个谜。正如许多微生物学家想要知道人体是如何区别好的微生物和坏的微生物，研究植物免疫的科学家们正试图去理解植物体如何与有益寄生者和平共处的。“所有这些微生物都会有PAMP，”唐格尔说，“你必须知道谁才是朋友。” 精准分子育种协助植物免疫系统进化 从历史上看，借助于育种方法一次只能导入一个抗性基因。但只需要一个氨基酸的突变就能让病原菌绕开新的抗性基因，因此，一个病原菌就能毁掉整片田里遗传背景相同的作物。“晚疫病导致的灾情已经是臭名昭著了。”瑞斯达里诺说。 因此，研究人员不再用单个基因来增强植物抵抗力，他们现在的目标是为植物提供“全副武装”，即含有多个抗性基因的全套装备。虽然传统育种也能达到这一目的，但科研人员和生物技术公司对更加精准的基因组编辑技术越来越感兴趣，比如新兴的CRISPR/Cas9系统。去年10月，韩国的科学家证实，他们能够利用CRISPR的向导RNA和Cas9酶对几种植物进行精确的基因改造，并且不会残留任何细菌DNA。同一个月中，杜邦公司宣称将与加州伯克利大学的卡里布生物科学公司进行技术合作并共享专利，以期在未来的五到十年内将CRISPR技术应用到农产品中去。 与常规育种技术相比，基因组编辑技术不仅在效率上极大提高，而且允许研究人员从野生种引入基因，而这些野生种由于在进化上相距较远而无法与驯化作物进行杂交或是杂交致后代不育。此外，使用常规育种技术将抗性基因成功引入作物中时，往往也带入了大量非预期的不良性状，随后还需要花费大量时间和精力将这些不良性状再通过回交和杂交等手段分离出去。“当你在进行杂交操作时，并不知道还引入了什么样的其他基因，”索姆斯奇说，而基因组编辑技术则“清楚得多”。 不过，与常规育种一样，基因工程方法也同样面临着与时俱进的挑战，需要时刻紧跟上病原菌快速适应进化的步伐。“实际上，你没办法让宿主植物保持稳定的抗性，除非十分了解病原菌随着抗性基因变化而进化的过程。”瑞斯达里诺说。 不过，如果植物学科学家们能够预测病原菌可能的进化方向，像病毒学家那样每年设计一款流感疫苗，基因组编辑技术也能帮助他们快速得到新的作物品种来适应病原菌的突变。卡蒙说：“我个人的观点是，这不仅是植物与病原菌之间的斗争，我们应该将它变成人类与病原菌之间的军备竞赛。” |
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