蛋白质相对分子质量的测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法【实验目的】理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基
本操作学会绘制标准曲线。【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉
双丙烯酰胺（Bis）聚合而成，是一种具有交叉网状结构的凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置药品的浓度来控制，常用作电泳
的载体。本实验利用了聚丙烯酰胺凝胶的电泳和分子筛双重作用。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种
阴离子表面活性剂，它的疏水端可以与蛋白质分子结合。绝大多数蛋白质与SDS结合的质量比为1.4:1，使蛋白质带上密度相同的负电荷，其
电荷强度远远强于蛋白质原有的电荷，这就掩盖因为蛋白质种类不同而造成的电荷差异，使电泳的迁移率仅与蛋白质的分子量有关。【实验器材】
DYCZ-24D型垂直板电泳仪移液管若干100mL烧杯微量进样器细长头吸管【试剂配制】1.分离胶和浓缩胶【试剂
配制】2.电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3）：取Tris6.0g，甘氨酸28.8g，SDS1.0g，用去离子水溶
解后定容至1L。3.样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白质）：取SDS0.1g，巯基乙醇0.1mL，甘油1.0mL，溴酚蓝2
8.8g，0.2mol/L磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸馏水至10mL。【试剂配制】4.染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，
加入454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。5.脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇6.10%过硫酸钠、10%
SDS、1%四甲基乙二胺（TEMED）【实验材料及预处理】可以配成单一标准蛋白质溶液，也可配制成混合蛋
白质标准溶液。将标准蛋白质和待测蛋白质用样品溶解液溶解，使浓度为0.5mg/mL，沸水浴加热3min，冷却至室温备用
。对以上标准蛋白质相对迁移率的测定，以相对迁移率的对数对标准蛋白质的相对分子质量作图，可得标准曲线，由标准曲线求出待
测蛋白质的相对分子质量。【实验步骤及操作方法】【实验步骤及操作方法】2.凝胶制备（1）分离胶分
离胶按下表加入试剂混合后的分离胶溶液，用细长头吸管加入玻璃板缝隙内，加胶高度距离样品模板梳齿下端约1cm，用
吸管在凝胶表面轻轻加一层蒸馏水（约3-4cm），使凝胶隔绝空气，并保持胶面平整。等待分离胶凝固后，将水倒出并用滤纸吸干剩余的水。
（2）.浓缩胶浓缩胶按下表加入试剂用细长头习惯将分离胶溶液加入分离胶上方，距离段玻璃板上沿0
.5cm处，然后轻轻加上模板梳，等待浓缩胶凝固后，小心取出模板梳，用手夹住两块玻璃板，取出胶室，去掉密封胶框，用1%电泳缓冲液琼脂
胶密封底部，再将胶室放入电泳槽，然后加入电泳缓冲液，内槽加到凹口以上，外槽加到具平直玻璃板上沿3mm处。3.电泳用微量
进样器取10-15μL样品，小心加入到凝胶凹槽内，待所有样品全部加完之后，打开电源开始电泳。电泳开始时，将电流调至10m
A，待样品到达分离胶与浓缩胶交界时，将电流调整至20-30mA，当溴酚蓝迁移到分离胶底部时，可以关闭电源停止电泳。4.染色与脱色
取出玻璃胶室，轻轻撬开玻璃板，取出凝胶。将凝胶转移到装有染色液的培养皿中，染色1h左右，然后取出，用蒸
馏水漂洗凝胶，转入脱色液中脱色，同时放在摇床上震荡，期间更换3-4次脱色液，直到可以清晰的分辨蛋白质条带。
5.结果处理【注意事项】每次实验必须绘制标准曲线，不得使用上一次的标准曲线处理
好的蛋白质样品液如果长期存放，使用前应先在沸水浴中加热1min以除去亚稳态聚合。若样品为溶液，则需要降样品溶解液浓度提高一倍，再
与样品等体积混合。在向玻璃缝隙中注胶时，应保持在一点加入，而加水时，要不断移动吸管。进样时，要注意不要太快或将凹槽加的太满，防
止样品溢出，对其他凹槽造成交叉污染。Acr和Bis均为神经毒剂，甲醇也是剧毒物质，使用应注意安全【对实验的思考】在配制样品
溶解液时，加入巯基乙醇是为了将蛋白质中的二硫键破坏，使蛋白质更容易与SDS结合。此实验时间较长，主要是由于染色脱色事件较长。由于
SDS可以吸附考马斯亮蓝，染色前可用脱色液浸泡凝胶，洗去SDS，可缩短染色及脱色时间。因此，我们可以测定
标准蛋白质的迁移率，通过标准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质量。
本实验就是依据这个原理进行测定的。100100（棕色瓶，冰箱中保存）100100（棕色瓶，冰箱中保存）定容体积/m
L5.9848浓缩胶缓冲液0.510浓缩胶贮存液36.348分离胶缓冲液0.830分离胶贮存液三
甲基氨基甲烷（Tris）/g1mol/L盐酸/mLBis/gAcr/g试剂名称选用5种相对分子
质量已知的蛋白质作为标准蛋白质：溶菌酶（Mr=14300）胰凝乳蛋白酶原（Mr=25000）胃蛋白酶（Mr=35000）卵
清蛋白（Mr=43000）血清白蛋白（Mr=67000）1.安装垂直板电泳槽将密封胶条放在平直玻璃板上，将凹形玻璃
板与平直玻璃板重叠。用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。用蒸馏水检漏置于磁力搅拌器中搅拌
2min0.110%过硫酸铵混匀2.01%TEMED10.2去离子水0.210%SDS2.5分离胶缓冲液5
.0分离胶贮存液操作体积试剂置于磁力搅拌器中搅拌2min0.0510%过硫酸铵4.60去离子水2.001%T
EMED1.25浓缩胶缓冲液3.00浓缩胶贮存液操作体积试剂以标准蛋白质的相对迁移率的对数对相对分子质量作图，得到标准曲线，根据标准曲线求出待测蛋白质的相对分子质量 |
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