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合成生物学之生物部件 622 （山东大学生命科学学院，济南，250100） 摘要：合成生物学强调“设计”和“重设计”，其目的是通过人工设计和构建自然界中不存在的生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题，其工程化的思想和标准化的工具一经兴起变得到全世界范围的广泛关注。生物系统的层次化结构是合成生物学本质化的典型体现，合成生物学系统中最简单最基本生物模块被称为生物部件（part），它是自下而上的研究策略中基础部分，本文回顾了合成生物学中常用的生物部件级标准化使用方法，着重介绍了启动子和核糖开关的相关研究进展。 关键词：合成生物学 生物部件 生物元件
1953年，年轻的J.D.Watson和F. Crick从DNA的X射线的X衍射图上解读了双螺旋结构，隐藏了几十亿年的生物密码逐渐露出端倪。2003年人类基因组计划顺利完成，此后包括人类在内的各种生物的图谱纷纷出炉，生物遗传密码的神秘面纱正在被迅速揭开。生物学由定性描述转向定量计算，从分析到设计，进入系统和合成生物学（synthetic biology）的的时代。 目前合成生物学的定义还处于多元化阶段，比较全面地可以概括为：合成生物学是指按照一定的规律和现有的知识，设计和建造新的生物部件、装置和系统，或重新设计已有的天然系统为人类的特殊目的服务。从这个定义来看，合成生物学包含自下而上的研究策略和自上而下的研究策略，对于前者的探索是艰深而富有划时代意义的。合成生物学最终期望是借鉴电子学的方法能能像“搭积木”一样构建基因线路，而这最基本的就是模块化元件。 我们称具有标准接口、功能相对独立生物大分子、信号转导路径、基因线路等为“模块”（module）或生物积块（BioBrick），模块的规模可大可小，大致可分为部件（part）、装置（device）、系统（System）及多细胞体系等几个层次，其中最基础的就是生物部件。模块化设计体现了合成生物学的精髓，模块往往具有信息隐藏，内聚耦合，封闭性开放性的特性。常见的生物部件按照功能可以分为启动子（promoter）、核开关（Riboswithch）、RBS、终止子、操纵子、蛋白编码基因（CDS）、报告基因、标签组件、操纵子等，当然这些分类层侧不是绝对的。
1. 启动子1.1 启动子的结构 启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，在原核生物和真核生物中是有差别的。 1.1.1 原核生物中的启动子 原核生物中的启动子通常，RNA聚合酶是依靠б因子识别DNA上的特定序列，б70是发现比较早也是比较常见的б因子，它通常特异识别启动子的-10和-35两个保守DNA盒子（如图 1）。
图 1 原核生物中的启动子模式图
1.1.2真核生物中启动子结构 相比原核生物的启动子，真核生物的启动子比较复杂，RNA聚合酶Ⅱ核心启动子是一个在转录过程中关键的但又容易被忽略的元件。核心启动子被定义为DNA的延伸，它涵盖了RNA的起始位点，典型的核心启动子大约有40到50核苷酸的长度，它指导基因转录的起始。在过去，人们推测核心启动子在功能上是通用的，转录起始是通过一种共享通用的机制进行的。最近的研究表明，各种核心启动子在结构和功能上都存在相当多的差异。存在大量的DNA元件作用于核心启动子的活性，给定核心启动子的特定性能是由这些核心启动子修饰因子的有无决定的。已知的核心启动子元件包括TATA盒子、Inr（起始子）、BREu｛ATA盒子的上游的BRE [TFⅡB（RNAⅡ聚合酶的转录因子）识别元件]｝和BREd（TATA盒子下游的BRE）、MTE（十基序元件）、DCE（下游核心元件）和DPE（下游核心启动子元件）（如图 2）。
图 2 真核生物中启动子模式图
1.2启动子的种类 在合成生物学以及以前的生物学研究中，我们已经标准化了许多启动子元件（如表格 1）。最经典的启动子是乳糖操纵子中的乳糖启动子，它可以被乳糖诱导，实验中我们常用IPTG诱导；色氨酸启动子引人注意的特性是有一段弱化子，可以根据细胞环境中色氨酸的浓度调控后续基因的表达；tac启动子则是上述两种启动子的融合启动子，是典型常用的强启动子；Pl、Pr是噬菌体溶源和裂解生长状态转化及维持中的重要启动子，阻遏蛋白的温度敏感突变可以使其收温度诱导；PtetA基因也是很常用启动子之一，可以被脱水四环素诱导；T7启动子则是比较特殊一种启动子，对RNA聚合酶的种类有特异性。 表格 1 常见启动子的概述
1.3启动子的调控及意义 为实现一些特定目的，微生物系统工程需要一些设计工具，这些工具以某种可预测的、定量的方式起作用。在合成生物学的领域，基因之间级联调控很多都是发生在转录水平（如图 3），而这些往往是在转录起始阶段起作用，也就是说与启动子有关，因此标准化设计启动子对整个系统的运转有重要意义。
图 3 在转录水平控制基因表达的设计工具 在自下而上的研究策略中，我们往往用基因线路模拟一些电子学上的逻辑开关，从简单逻辑或与非，到双稳态开关，再到震荡子（如图 4）实质上都是上面提到的启动子及其调控基因按照一定次序设计排列的结果。 此外，在合成生物学学术比赛iGEM中，相当多的队伍作品的关键都是发现或者标准化了一些有特殊功能启动子及其相关组件，比如感光、温度敏感、感受重金属离子等。
图 4 双稳态开关（左）及震荡子（右）的逻辑结构
2．核糖开关在1991年，人们就发现E.coli的btuB基因转录产物5’-UTR存在高度保守序列，并发现Ado-cbl和B12可以使btnB基因表达，但没有发现可以与Ado-cbl结合的蛋白因子；1990年，Andrew从随即合成的RNA序列中筛选出特异性结合有机染料配体的RNA，并命名为“aptamer”（适体）；2002年，Breaker受到适体的启发，证明了这种天然适体的存在，命名为“核糖开关”。到目前（2009年）为至已经发现了不少于 12 个核糖开关（如表格 2），大部分是抑制性的（当存在相应代谢物时基因关闭）。主要参与氨基酸、核苷酸、维生素等基础物质的代谢。
表格 2 一些已知的Riboswithch的名称、调节小分子和功能
核糖开关中，mRNA 本身作为传感器 ,直接感受环境中相应代谢物的变化 ,结合代谢物后发生构象变化 ,在转录和翻译水平调节基因的表达。核糖开关也是一种反馈调节机制 ,与以往发现的调节机制的区别是：它不需要任何蛋白质（乳糖操纵子）或核糖体（色氨酸弱化子）作为中介 ,由 RNA 直接感受环境中代谢物的变化 ,通过形成选择性茎环结构 ,在转录延伸和翻译起始水平调节基因表达。 2.1核糖开关的作用机制 已发现的细菌核糖开关均位于代谢相关基因mRNA的 5′UTR，由 2 个结构域组成 :适体结构域(aptamer domain，AD) 和 表 达 结 构 域 ( expression domain, EPD)。AD 直接结合小分子代谢物，是RNA 传感器. 序列分析表明，在不同细菌的同类核糖开关中，AD 序列保守，形成高度相似的二级结构。与配体结合后，AD 发生构象变化，信息传递至 EPD ，后者通过形成选择性茎环结构，直接调节基因的表达。不同核糖开关的 EPD 可能利用不同的机制调节基因表达。（如图 5） 目前发现的真核生物的核糖开关位于 3′UTR 或内含子，也具有相似的 AD 和 EPD，可能在多个环节调节真核生物基因表达。
图 5 核糖开关的作用机制 为研究核糖开关的作用机制，F.J.Isaacs等构建了人工的Riboswithch（如图 6），这种转录后调控比转录水平的调控更加迅速。基因正常表达时，启动子P控制gfp的表达。转录形成的mRNA的RBS暴露在外，一旦核糖体识别并与之结合以后，mRNA既可以翻译成蛋白质。而在人工构建Riboswithch中，在启动子Pcr和RBS中间插入一段与RBS互补的cr序列。转录后mRNA5’与RBS结合形成发卡结构，将RBS掩盖阻止核糖体与之结合，从而组织翻译的进行。另一个启动子Pta启动后表达一个短链非编码RNA——taRNA。taRNA能以高度特异性优先定位于crRNA，共经过线性-环相互作用将crRNA的发卡环解开，taRNA的尾部与crRNA互补配对。此时，crRNA的RBS位点暴露在外，核糖体可与之结合重新激活翻译。
2.2核糖开关的应用 2.2.1小分子抗菌药物 riboswitch 在人类细菌性病原体内分布广泛（如），预示着将riboswitch 作为药靶将会有广阔的应用前景。 临床上一些常用抗菌药物的毒性机制已经被证实是以riboswitch 为药靶的．例如吡啶磺胺(pyrithiamine，PT)，一种常用的硫胺代谢对抗物，是维生素B1 （Thiamine ，硫胺素）的类似物。它在细胞内很容易磷酸化成吡啶磺胺焦磷酸盐PTPP)。PTPP 可以与许多TPP riboswitch 结合(其亲和性与TPP 类似)，从而抑制由TPP riboswitch 控制的基因表达。
图 6 用于控制转录后基因调控的人工Riboswithch系统
表格 3 一些含有Riboswithch调控的人类细菌性病原体
2.2.2细菌趋向运动 细菌的趋向运动的研究在生物降解、生物纳米、合成生物学等领域具有重要意义。Shana Topp等人在大肠杆菌中设计一个通过小分子和mRNA来指导细菌运动的系统。 在野生型的大肠杆菌中，鞭毛马达的旋转方向有蛋白CheY控制，当CheY没有被磷酸化时，鞭毛马达逆时针旋转；当CheY被磷酸化后，CheY-P可以和鞭毛马达蛋白FliM结合，导致细胞滚动；因此野生型大肠杆菌可以在半固体琼脂上迁移。然而，在CheZ蛋白缺失时，CheY-P不能去磷酸化，细胞只能翻滚不能迁移。（如图 7） 研究人员在CheZ蛋白的编码基因前设计了核糖开关（如图 8左），它只有和茶碱结合后才能改变构型与核糖体结合翻译出CheZ使细胞运动。所以导致了改造后的大肠杆菌只会在有茶碱存在的区域迁移（如图 8右）。
图 7 大肠杆菌CheY与其运动的关系
图 8 Riboswithch设计（左）与实验结果（右）
3.生物部件的讨论生物部件是最简单、最基本的生物积块，能有通过标准化的组装方法与其他part组装成更加复杂的模块。目前，生物部件的数量和质量都达不到合成生物学所期望的要求。部件的开发存在一些问题。 如此庞大的部件库需要对每个部件进行恰当的命名，这一点通过严格统一规范去实现并不难。 生物部件之间的连接之前也是一个大问题，往往通过复杂的酶切位点的设计来实现，但随着一些新的组装手段的出现，这变得很容易。 比较难以解决的问题是标准定量机制，虽然已经有了PoPS（RNA polymerase per second）、RIPS（ribosonmal initiations per secon）的概念，但是这只是具有一定量化作用的抽象概念，合成生物学基因部件定量的标准化还远不及模块本身的进程那么快速普遍，许多研究者正在寻找更加通用、更加直观的衡量方法和更直接的测量手段。 参考文献 1.Molecular Biology of the Gene sixth edition 2.合成生物学导论 宋凯编著 3. Perspectives On The RNA Polymerase II Core Promoter Biochemical Society Transactions, 2006, 34(Pt 6): 1047-1050. 4. Seo S W, Yang J, Min B E, et al. Synthetic biology: Tools to design microbes for the production of chemicals and fuels[J]. Biotechnology advances, 2013, 31(6): 811-817. 5.赵文超, 薛永常, 王雪霞. 核糖开关——一种基因表达调控元件[J]. 生命的化学, 2009 (1): 56-59. 6.赵谨, 杨克恭, 张学. 一种新发现的基因表达调控机制——核糖开关[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2005, 21(2): 151-157. 7. Isaacs F J, Dwyer D J, Ding C, et al. Engineered riboregulators enable post-transcriptional control of gene expression[J]. Nature biotechnology, 2004, 22(7): 841-847 8.余光创, 秦宜德, 伯晓晨, 等. 依赖于 5′ 端非编码区高级结构的真核生物 mRNA 翻译调控[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2007, 23(11): 881-887 |
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