告诉你一种观测荚膜的新方法

今天跟微生物室的同事探讨细菌荚膜时，讨论了细菌荚膜染色的几种方法；突然想到如果联合使用OLYMPUS-BX50型显微镜及其成像系统与荚膜墨汁染色，会不会收获很理想的成效呢？让我们用实验进行验证吧。

一、仪器与材料

OLYMPUS-BX50型显微镜及其成像系统，酒精灯，接种环，载玻片，盖玻片，无菌生理盐水，国产英雄墨汁（印度墨汁效果更佳），肺炎克雷伯菌纯菌落。

二、方法

1、灼烧接种环，取2-3环无菌生理盐水，置于载玻片上。

2、灼烧接种环，取肺炎克雷伯菌落边缘部少许，均匀涂布于生理盐水中，因为（麦康凯平板）肺炎克雷伯菌的菌落比较粘，因此需要研磨均匀，形成均质菌液。

3、灼烧接种环，取1环国产英雄墨汁均匀涂布于菌液中，研磨均匀。灼烧接种环。

4、加盖玻片，注意尽可能避免气泡。

三、结果

1、普通显微镜高倍镜检效果如下图所示。可见散在分布的气泡样细菌荚膜结构，但是，看不清细菌具体形态特征；在菌量较少时，由于看不清微小透亮区内部的微小结构，与微小气泡等许多干扰物质难以辨别区分。

2、使用OLYMPUS-BX50型显微镜及其成像系统，观察效果如下图所示。可见明显的细菌荚膜结构，而普通革兰染色时只能看到菌体周围有一圈未着色的透明带；同时，有了黑色背景的衬托，可以更加清晰的看到细菌的形态特征，单个或成双排列，短杆状、杆状，这是普通显微镜高倍镜无法达到的效果，又与该菌革兰染色特征基本相符。

四、分析与总结

肺炎克雷白菌为革兰阴性杆菌，大小为（0.3～1.5）μm×（0.6～6.0）μm，单个、成双或短链排列，具有荚膜结构。

墨汁染色通常用于检查脑脊液或分泌物涂片中的隐球菌，具有方便、快速、节约成本等优点，是涂片中检查隐球菌感染的首选方法。《临床微生物诊断与图谱（第二版）》指出，荚膜对碱性染料的亲和性比较低，不易被着色，普通革兰染色时只能看到菌体周围有一圈未着色的透明带，如用墨汁作负染色，则荚膜显现更为清楚。由此可知，在观察新型隐球菌（5～20μm）时，可直接使用墨汁染色的方法观察其荚膜结构；而观察体积更小的细菌荚膜时，普通革兰染色效果并不理想，需使用专门的荚膜染色进行油镜观察，也有使用墨汁负染（干墨汁法）进行油镜观察，这些方法显然均比联合使用OLYMPUS-BX50型显微镜及其成像系统与荚膜墨汁染色耗时。

OLYMPUS-BX50型显微镜及其成像系统属于比较成熟的技术，可将显微镜下观察的目标成倍放大投射到显示器屏幕上，因此，可以观察目标的微小结构；但是，如果直接观察肺炎克雷白菌菌液涂片（湿片，直接涂片法）时，由于荚膜透明无法与生理盐水的无色背景区分。因此联合使用OLYMPUS-BX50型显微镜及其成像系统与荚膜墨汁染色时，既可观察到细菌荚膜结构，排除微小气泡等干扰物的影响，又可初步观察菌体的形态特征，还节省耗时，可达到快速检测细菌荚膜的目的。

由于盖玻片下墨汁厚度相对于肺炎克雷白菌体较厚，因此，会有墨汁中的颗粒影响光线，造成镜下观察到的荚膜显得不是太圆，但可通过调节细准焦螺旋进行改善，整体上并不影响荚膜结构的判读。

综上所述，通过所设计的实验验证，OLYMPUS-BX50型显微镜及其成像系统与荚膜墨汁染色的联合应用，在快速检测细菌荚膜方面是可行的。

本文作者：位冒冒，河南省安阳市人民医院检验科