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【分子生物学技术】PCR技术原理与应用

2017-11-09  在吗忧伤...

PCR技术原理与应用

一、实验目的:

1、理解PCR的技术原理;2、了解PCR的应用领域


二、实验原理:

1 概念

PCR(Polymerasechain reaction,聚合酶链式反应)是模拟体内DNA复制过程,对特定DNA序列进行大量扩增的一种技术。 PCR反应是以4种dNTP为底物,引物引导,DNA聚合酶催化作用下,在单链DNA模板3’末端开始进行互补链的延伸,多次反复的扩增使特定DNA序列以指数增加。


2、PCR反应体系

参与PCR反应的物质主要为包括:引物、酶、dNTP、Buffer、模板和Mg2+


2.1 引物

引物是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段的长度,两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应. 引物设计一般考虑以下几个方面:


2.1.1 引物长度

PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。

引物的长度一般为15-30bp,常用的是18~27bp,最佳为20~24bp。引物过短时会造成Tm值过低,在酶反应温度时不能与模板很好的配对;引物过长时又会造成Tm值过高,超过酶反应的最适温度,还会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。


2.1.2 引物碱基构成

引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在,3′端不应超过3个连续的G或C,因为这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。两个引物中(g+c)%含量应尽量相似,在已知扩增片段(g+c)%含量时宜接近于待扩增片段,一般以40%~60%为佳,过高或过低都不利于引发反应。Tm值是一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸互补双链解链的温度。Tm=4(G+C)+2(A+T)。

两条引物之间避免有同源序列,尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段,否则两条引物会相互竞争模板的同一位点;同样,引物与待扩增目标DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则,引物就会与其它位点结合,使特异扩增减少,非特异扩增增加。


2.1.3引物二级结构

引物应避免内部形成明显的二级结构,尤其是发夹结构。引物自身形成的二级结构包括二聚体、发卡结构、引物间二聚体等,会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。特别是在引物的3’末端,尽量避免出现这些二级结构。


2.1.4引物3’端序列

DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸,所以,引物3’端5~6个碱基与目标DNA的配对要求必须精确和严格,这样才能保证PCR有效扩增。正、反向引物互相不能互补,尤其是在3’末端,否则容易形成引物二聚体。

引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定,一般考虑末端5个碱基的ΔG。G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端G值较低(绝对值不超过9),负值大,则3’末端稳定性高,扩增效率更高。引物的3’端的G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。应当避免在引物的3’端使用碱基A,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基。


2.1.5引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两个酶切位点,应在后续方案设计完毕后确定,便于后期的克隆实验,特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。


2.1.6引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源,特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。


2.2 DNA聚合酶

Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶,是从水栖高温菌(Thermus aquaticus)中分离的,由分子量为109000的一条多肽链构成。dna聚合酶具有几种功能:一是聚合作用,以DNA为模板,将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3’末端。二是有3’→5’外切酶活力,能识别和消除错配的引物末端,与复制过程中校正功能有关。三是5’→3’外切酶活力,它能从5’端水解核苷酸,还能经过几个核苷酸起作用,切除错配的核苷酸。在体外实验中,Taq DNA聚合酶的出错率为10-4~10-5

Taq DNA聚合酶具有以下特点:

(1)耐高温,在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上,在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%,而在95℃下反应2小时后为原来的40%。

(2)在热变性时不会被钝化,故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。

(3)一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb,且特异性也较高。

一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u(总反应体积为50ml时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。


2.3 dNTP

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。在PCR反应中,dNTP应为50~200mmol/l, 4种dNTP的浓度要相等。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。


2.4 模板DNA

模板DNA的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一。特别是以基因组DNA作为模版时,DNA提取过程中未去除干净的蛋白质、糖类、脂类、酚类及各种离子等杂质,会干扰PCR扩增反应,影响PCR产物的质量和数量。

模板DNA过高或过低都会影响PCR实验的结果。

2.5 Mg2+

在PCR反应中,各种dNTP浓度为200mmol/l时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/l为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

一般厂商提供的Taq DNA聚合酶均有相应的缓冲液,其中已含有一定浓度的Mg2+。在PCR反应体系中可以根据具体情况添加一定量的Mg2+


3 PCR反应流程

PCR循环过程包括三部分:模板变性、引物退火、DNA链延伸合成。


3.1 模板DNA的变性

模板DNA加热到90~95℃时,双螺旋结构的氢键断裂,双链解开成为单链,以便它与引物结合。变性温度低则变性不完全,dna双链会很快复性,因而减少产量。变性温度不能过高,变性时间应尽量缩短,以保持taqdna聚合酶的活力。PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。G-C间由三个氢键连接,而A-T间只有两个氢键相连,所以G-C含量较高的模板,其解链温度相对要高。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜(DMSO),并且在PCR循环中起始阶段进行热启动。


3.2 模板DNA与引物的退火

将反应混合物温度降低至37~65℃时,寡核苷酸引物与单链模板杂交,形成DNA模板-引物复合物,即复性。退火温度决定PCR产物的特异性与产量。退火温度高,特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;退火温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般实验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的解链温度Tm(melting temperature)低5℃,可按公式进行计算:Ta =Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃。在反应体系中引物的浓度大大高于模板DNA的浓度,并且引物的长度显著短于模板的长度,因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多。退火时间一般为1~2min。


3.3 引物的延伸

DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA链互补的新链。引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适温度, 一般为70~75℃。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。一般在72℃条件下,Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40~60个碱基/秒,其速度取决于缓冲溶液的组成、ph值、盐浓度与DNA模板的性质。

PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%。反应初期,目的DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台效应。

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。引物如果跟原始DNA模板结合,从3'端开始扩增延伸,其产物的5'端是固定的,3'端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。引物如果是以新合成的DNA链(即“长产物片段”)为模板扩增时,模板的5'端序列是固定位置的,即新合成延伸链的3'端是固定的,使新合成DNA链的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。由于新合成的DNA链在下一个循环反应中可以作为引物结合扩增的模板,“短产物片段”是按指数倍数增加。而原始DNA模版的量是固定的,“长产物片段”只按算术倍数增加,在最终PCR中的含量几乎可以忽略不计。

一般PCR反应包括上述变性-退火-延伸三个温度点。但在扩增某些较短目标序列(长度为100~300bp时)时,可采用二温度点法,即把退火与延伸温度合二为一。


3.4 循环次数

PCR循环次数一般为25~40个。循环次数过多,非特异性背景严重,复杂度增加。循环反应的次数太少,则产率偏低。


4 PCR反应特点

4.1强特异性

PCR反应的特异性决定因素为:

(1)引物与模板DNA特异性的结合;

(2)碱基配对原则;

(3)Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;

(4)目标基因序列的特异性与保守性。


4.2 高灵敏度

在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,其灵敏度可达到白万分之一。


4.3 快速简便

PCR反应可在PCR仪上进行,一般在2~4小时完成。如采用特殊PCR仪(荧光时时定量PCR仪)则可全程监测PCR反应的结果,故耗时将更短。


5 应用领域

5.1 PCR技术在生命科学领域的应用

5.1.1特定DNA序列的克隆与重组子的鉴定

5.1.2 DNA的体外定点突变与分析

5.1.3染色体DNA的引物原位杂交

5.1.4 DNA洗牌术(Shuffling)

5.2 PCR技术在临床医学方面的应用

5.2.1检测病原体

5.2.2临床疾病诊断


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