如何拍一张好看的细胞核？

2525年，也就是还有500年，星盟就要和人类宣战了。换句话说，我们只剩下不到500年的时间用来改造出斯巴达战士。想要改造出斯巴达战士，必定要先详细的了解我们人类细胞的细胞核是啥样的，而要搞清楚啥样，首选肯定是对细胞核进行成像。先不说人类现在生物成像技术如何（当然和星盟们的科技差远了），我们就来看看众多生物科研人士对于成像的拙劣的态度。下图呢是某著名杂志最近的某篇文章里面染的细胞核（DAPI染色），恕我直言，我用我手机对着一台普通二手显微镜的目镜都能拍得更好。

我猜，作者大概用的是苹果产品，所以才会拍成这个样子。

基于染料的细胞核成像可以说是非常非常简单的了，把细胞一杀，然后染料一染，就可以到显微镜下拍了，比泡方便面还简单。但是，要拍到一张品质极佳的细胞核，真的要是有这么简单就怪了。私以为，想要拍到一张极好的细胞核，你需要选择正确的固定方法，选择一台高级的显微镜，最重要的是你需要买一台微软的surface。

N天前，我尝试了六种不同的固定方法（固定的是HeLa细胞，用Hoechst 33342染色），并且把他们拿到了一台我半年用一次的屌丝显微镜（Leica DMi8，最低配置）下看了看，没错，屌丝显微镜，汞灯，手动调焦，空气镜，普通相机下，都比上面拍得好，见下图。

似乎啊，六种不同固定方法并木有什么大的差别。但是，这种分辨率和我的身份是不相符合的，想要拍出一张极好的细胞核，用这种屌丝显微镜还不如让我退学，因此直接上超高。在SIM下，这六种固定方法高下立判，见下图：

底下三个我不想多说，请直接出门左转去苹果专卖店。来说说上面的，4%PFA，最常见的固定方法，果然，效果很好，结构清晰，唯一缺点是细胞会有一点点膨胀（data not shown）。借鉴电镜的做法，加了点戊二醛之后，这种膨胀就消失了惹，然而却引入了本底荧光（请用NaBH4淬灭之），导致信噪比下降，分辨率降低。让我没想到的是，乙醇加冰醋酸竟然效果还不错，众所周知，冰醋酸用来做RNA FISH是极好的（我猜没几个人知道），哪天有空我用此固定方法来试个RNA染色，等着后续吧。反正，我看来，还是PFA 戊二醛最好，所以，固定方法敲定，3%PFA 0.1%戊二醛，毕竟此固定方法在SIM下连核孔都看得到，如下图：

第二个，就是需要一台好的显微镜，第一台屌丝镜和上面的GE·DeltaVision·OMX·V4·3D·SIM形成了鲜明的对比，这部分都可以不讲了。。。但是，有人要说了，我没SIM咋办，你总有一台带油镜和制冷的CCD的荧光显微镜吧。怒拿PFA 戊二醛样品在不靠谱的DeltaVision Elite下，拍个照再Deconvolution一下（没错，有人天真的以为Deconvolution 是压背景，傅里叶直接坟头蹦迪），如下图：

效果还是不错滴，比第一个好多了惹。你没看错，我没标错，在我们的神机下，NA=1.42的镜头成像下来，分辨率还不如NA=1.40的，你知道为啥么？（第一个后台回复答对的微信红包5元，没错，我就是奖励那些聪明的人）

到这里，细胞核的成像质量已经甩了文章开头那Cell子刊三条南京路，但是，有人又说了，我们没有带制冷的相机的显微镜（比如我们所就没有），那咋办？总有CLSM吧，我们所里都有的（你不要告诉我你不知道CLSM是激光共聚焦显微镜的缩写）。本着我大微软普渡众生的思想，把PFA 戊二醛的样品拿到了一台Leica SP8（带HyD和Huygens，当然还带了个STED，我们所并没有）下面去瞧了瞧。如下图：

原始图质量已经将就了，再用Huygens deconvolution一下，分辨率，信噪比得到极大提高，简直完美！（这里可以看出，DeltaVision的质量还是可以比得上共聚焦的，虽然对比度还是不够好）但是，我还是不满足，我想要更高的分辨率！那咋办，开强激光，多average几次，调小pinhole咯，怒调pinhole到0.8再到0.5，如下图：

天了噜，分辨率都快赶上SIM了！基于直觉再加上以前没看过，我赶紧拍了个三维的，去和SIM对比。结果，SP8拍个三维细胞核，要7min......7min.......而我SIM只用60s.......1/7时间。好吧，谁叫SIM用的是sCMOS呢？拍完后，我们看看SIM和SP8 z方向的分辨率，如下图：

再来看看SP8和SIM的三维对比（上SP8，下SIM）：

          

  

SP8的轴向分辨率还是可圈可点的，当然，还是比不上SIM来得高端大气，轴向分辨率都可以比人家横向分辨率高，但是啊，伪影还是个大问题，毕竟需要算啊，毕竟我没自己采集一套PSF。当然了，别的超高我就不对比了，原因是，对于STED我没染料，对于STORM这些，显微镜太远了........（不过总有一天我要搞一期超高大战的！）

所以，只要你认真了，用共聚焦哪怕屌丝显微镜也可以拍出很好的细胞核，而不至于像最开始那篇神文里面这么寒酸。然而说了这么多，我还是想提醒一句，固定的细胞都不是本质的，只有活细胞成像才更接近于真理：

你们看，活细胞状态下，简直长得都不一样！但是活细胞难啊，没办法还是拍固定细胞就好了，反正比起生化分子实验那种连细胞都给搞没了的实验来得真实太多。然后，看个活细胞细胞核SIM成像下重构出来的视频：

所以呢，拍个好看的细胞核是非常非常简单的，正确的固定方法加好的显微镜。（对于HeLa细胞，我推荐的方法是3%PFA 0.1%戊二醛，室温固定10min，5ug/ml Hoechst 33342染色10min，非凝固封片剂封片，如果用CLSM，请用高NA的油镜，pinhole调到0.5（反正染料亮），pixsize在40nm/pix左右，average个几次，有条件，在成像质量不错的情况下deconvolution一下；然而，我还是喜欢SIM，因为我很忙，不希望浪费时间）当然，这是对于我而言，对于普通用户呢，我还是劝大家趁早放弃或者买一台surface。

那有人说，你拍染料染的细胞核拍得再好有什么用，呵呵，去多看点文章。