CAR-T新策略：纳米颗粒携带CAR载体在体内产生CAR-T细胞

CAR-T效果好，潜力巨大，但是流程过于复杂，完整的治疗过程（图1）包括从病人体内单采血浆，流式分选细胞，CAR病毒制备，CAR病毒感染T细胞，CAR-T细胞扩大培养，质检后输回病人体内等几个大步骤，每个大步骤又包含多个小步骤，对实验室条件和操作等要求也非常高，导致治疗门槛很高。已经上市的CAR-T疗法售价更是堪称天价。

图1--CAR-T治疗的流程

不久前，Fred Hutchinson癌症研究中心的研究人员Nature Nanotechnology 杂志发表题为：In situ programming of leukaemia-specific T cells using synthetic DNA nanocarriers 的文章（图2），使用纳米材料将CAR表达质粒包裹后输入小鼠血液中，将小鼠体内的T细胞变成能够杀伤肿瘤的CAR-T细胞。该研究为CAR-T细胞治疗提供了一种新的思路。

图2

我们先看结果，首先，在体外细胞实验上，纳米颗粒成功识别、结合在T细胞表面，并进入到T细胞内（图3）。

图3-绿色为T细胞，紫色为纳米颗粒

纳米颗粒进入T细胞后形成的CAR-T细胞，与用慢病毒制备的CAR-T细胞对比，对白血病细胞和黑色素瘤细胞的杀伤效果相当（图4）。

图5-纳米颗粒CAR-T与慢病毒CAR-T对肿瘤细胞的杀伤效果对比

在小鼠体内实验中，将CAR纳米颗粒注射进入小鼠体内，4个小时后可以看到，CAR纳米颗粒结合并进入T细胞（图6）。值得注意的是，纳米材料的非特异性结合较强。

图6

真正验证结果的时候来了，Nanoparticlesencoding 194-1BBz CARs iPB7 transposase实验组对肿瘤的控制非常明显，与传统慢病毒制备CAR-T效果相当（图7）。

图7-纳米颗粒CAR-T与慢病毒CAR-T对小鼠体内肿瘤的抑制效果比较

总结一下实验结果：纳米颗粒制备的CAR-T能够有效的识别与结合T细胞，并能够进入T细胞，进而对肿瘤进行有效的杀伤，其效果与传统使用慢病毒制备的CAR-T效果相当。目前存在的缺陷是非特异性识别率偏高。

那么问题来了，既然效果相当，而且还存在缺陷，为什么不继续优化传统CAR-T却来折腾纳米CAR-T呢？

因为纳米颗粒CAR-T流程简单啊，我们来对比一下这两种方法的流程（图8）。下图左为纳米颗粒制备CAR-T治疗的流程，图右为传统慢病毒制备CAR-T治疗的流程。

图8-纳米颗粒制备CAR-T疗法（左）与慢病毒制备CAR-T疗法流程（右）

所以纳米颗粒制备CAR-T的方法相比传统方法在流程上简化了很多，必然回带来治疗成本商的大幅下降。这个方法刚刚开始，现在面临的一些问题未必不能解决。

既然纳米颗粒制备CAR-T这个新方法疗效如此显著，流程又如此简介，那么，这个纳米颗粒又是怎么制作的呢？

纳米颗粒的结构（图9），其表面是一层结合CD3抗体的多聚谷氨酸（PGA），内部由表达CAR的质粒DNA和多聚物组成，PGA-anti-CD3包裹在DNA-多聚物表面。加CD3抗体是因为CD3是T细胞表面的广泛表达的标志物，因此结合CD3抗体可以增强纳米颗粒结合T细胞的特异性。值得一提的是，质粒DNA包括了一个iPB7转座酶质粒，用于将CAR整合进T细胞基因组，从而保证CAR不会随细胞分裂而丢失。

图9-纳米颗粒结构

纳米颗粒的组装方法（图10），首先把结合了核定位信号肽（ NLS）和微管相关序列（MTAS）的多聚物polymer与质粒DNA按照质量比例为30:1混合，由于纳米材料带正电荷，而DNA带负电荷，两种材料紧密结合，由于纳米材料远多于DNA，混合物整体带正电。然后加入带负电荷的PGA-anti-CD3，最终就形成了能够原位产生CAR的纳米颗粒（Nanoparticle），冻干保存，使用特定的缓冲液溶解后注射进入血液即可。

图10-纳米颗粒的组装方法

纳米颗粒制备CAR-T细胞相比传统CAR-T在流程上大大简化，而且在小鼠水平上的疗效不相上下，如果进一步解决纳米颗粒的非特异性识别问题，该方法会有更大的前景。该方法为CAR-T提供了一个新的思路，也显示跨学科研究的巨大威力。