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CRISPR/Cas9基因编辑技术实在太强大，确实可以想尽各种办法去“玩”，从基因敲除、基因插入、单碱基基因编辑、大片段基因敲除到RNA编辑等，似乎只有你想不到没有做不到的。然而或许有人会问，CRISPR/Cas9能敲除整条染色体吗？听起来觉得还有点距离，然而11月25日，Genome Biology杂志上就发表了由中科院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组与北京大学胡家志实验室合作完成的题为“CRISPR/Cas9-mediated targeted chromosome elimination”的研究论文，该研究介绍了CRISPR/Cas9技术、在细胞、胚胎或体内组织中，针对目标染色体进行多个DNA剪切，可以选择性消除单条染色体。这项技术为动物模型的建立以及非整倍体疾病的治疗提供了新的方法。 杨辉研究员自回国在中科院神经所建立实验室以来，主要从事基因CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用研究病着手建立基因修饰猴的许多疾病模型，致力于各种CRISPR相关工具的开发及优化，包括CRISPR激活系统、CRISPR标记系统和CRISPR介导的成体治疗等等。同时，异种嵌合动物的高效制作和应用也是该实验室的一个新兴方向。 杨辉实验室成立于2014年，积累了短短三年之后，在今年连续发表了多项研究成果。其中，今年5月和6月发表了两篇Cell Research论文，其中一项工作建立了一种新的基于HMEJ的靶向精确整合策略，即利用带有单个向导RNA（sgRNA）靶向位点和长同源臂（约800bp）的供体载体来实现高效的精确整合【1】（与施霖宇团队、孙强团队合作完成）；另一项工作则是通过将多个针对基因外显子的连续指导RNA（sgRNA）注射到受精卵中，可以高通量制作各种基因完全敲除小鼠并用于表型分析，并快速制作基因敲除猴模型【2】（与熊志奇研究组以及孙强团队合作完成）。 在最新的这项研究中，研究人员为了利用CRISPR/Cas9实现整条染色体的基因敲除，他们首先应用CRISPR/Cas9介导的针对Y染色体的多位点DNA切割可以有效地将小鼠胚胎干细胞的Y染色消除。这种多位点剪切可通过单个sgRNA靶向结合多个特异的染色体位点，或者通过14个sgRNA分别结合各自的特异位点来达到。此外，他们还发现小鼠X染色体，人的7号和14号染色体都可以通过这种方法消除。更为重要的是，唐氏综合症病人的iPS细胞中的21号染色体也可以通过这种方法特异性消除。因此，该研究第一次证明性染色体和常染色体可以通过基因编辑特异性消除。
或许读者会问，这项技术有何应用前景？难道只是为了“炫酷”？ 当然不是为了炫酷了。实际情况是这样的，人类遗传性疾病中有一类是由于染色体的非整倍性造成的，比如我们熟知的唐氏综合征（多了一条21号染色体）和Klinefelter综合征（比正常男性多了1条X染色体，因此又称为47-XXY综合征。患者有类无睾身材、男性乳房发育、小睾丸、无精子及尿中促性腺激素增高等）。另外，许多肿瘤中也存在许多非整倍性的染色体。因此，利用CRISPR/Cas9介导的染色体去除技术为治疗非整倍性疾病提供了一种潜在的可能，虽然看起来离应用还有很长一段时间。 这项技术的原理简单来说就是，设计多条sgRNA破坏单一染色体上在多个位点都存在的重复序列，理论上一条染色体有许许多多重复的序列，如果用CRISPR/Cas9剪刀在这样的序列上反复的剪切，最后连体内的修复机器也没法修补，那么多次剪切后的染色体理论上不再能很好的发挥生物学效应。 据杨辉博士透露，这项技术目前的主要挑战在于如何大量引入多个DNA切割。不同的重复序列之间的染色体去除效率不同，并且很难去预测这些重复序列是否工作的很好。另外一个挑战就是如何选择性的去靶向两条或三条同源染色体中的特定一条染色体。 最后值得一提的是，据杨辉博士在朋友圈透露，这是该实验室目前经历时间最长的paper，也经历了不少坎坷。不过，笔者想说的是，实验室才建立了3年，其实也不算长嘛。且不说已经发了两篇Cell Research和一篇EBio Medicine，都是研究性论文【1,2,3】。 据悉，杨辉研究员和胡家志研究员为本文的共同通讯作者，左二伟、霍小娜、姚璇、胡新德、孙怡迪和尹健行为论文的共同第一作者。 参考文献： 1、Yao, X., Wang, X., Hu, X., Liu, Z., Liu, J., Zhou, H., Shen, X., Wei, Y., Huang, Z., Ying, W., Wang, Y., Nie, Y. H., Zhang, C. C., Li, S., Cheng, L., Wang, Q., Wu, Y., Huang, P., Sun, Q.#, Shi, L.#, Yang, H.# (2017). Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Res. 27, 801-814. 2、Zuo, E., Cai, Y.J., Li, K., Wei, Y., Wang, B.A., Sun, Y., Liu, Z., Liu, J., Hu, X., Wei, W., Huo, X., Shi, L., Tang, C., Liang, D., Wang, Y., Nie, Y. H., Zhang, C. C., Yao, X., Wang, X., Zhou, C., Ying, W., Wang, Q., Chen, R. C., Shen, Q., Xu, G. L., Li, J. Sun, Q.#, Xiong, Z.#, Yang, H.# (2017). One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res.27:933-945 3、Yao, X., Wang, X., Liu, J., Hu, X., Shi, L., Shen, X., Ying, W., Sun, X., Wang, X., Huang, P.#, Yang, H.# (2017). CRISPR/Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBio Medicine.
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来自： zhongguorui > 《文献导读》
图为用CRISPR/Cas9介导的Y染色体敲除获得特纳综合征小鼠。a. Y染色体基因靶向位点示意图。b. 实验设计。将Cas9 mRNA和2个特异靶向Rbmy1a1，Ssty1, Ssty2或Kdm5d基因的sgRNAs分别注射到小鼠受精卵。c. 所获小鼠的性别比例。d. 12周的XO小鼠。e. XO小鼠的DNA FISH结果。
