三代全长转录组的研究思路

近年来，随着高通量测序技术的发展，测序成本不断下降，转录组测序已经成为研究基因表达调控的主要手段。然而，传统的二代测序技术由于读长短、GC敏感等因素，组装出来的unigene拼接较短、转录本结构不完整。另外，真核生物中，多数基因是存在可变剪接的，产生多种转录本，这进一步对二代转录组测序造成了挑战，其组装的转录本重构准确率较低。

基于PacBio单分子实时测序技术，平均10-15Kb读长的数据可以轻松跨越从5’末端到3’-Poly A tail的完整转录本，这样无需组装，可获得mRNA的全长转录本。全长转录组测序更侧重于优化mRNA的结构，能够对mRNA的同源异构体、可变剪接、基因融合、同源基因、超家族基因和等位基因等进行精确分析，即便是研究比较透彻的人类基因组，也能找到新基因和新转录本。

下面我们以毛竹全长转录组详细介绍下此类文章的研究思路，该文章2017年发表在《The Plant Journal》（IF = 5.9）上。

研究背景

毛竹（Phyllostachys edulis）是世界上生长速度最快的植物之一，它的茎在38天内平均生长13米，这主要受益于其将幼苗与其他成熟竹子连接起来的发达的根茎系统。它对能量储存、运输和营养繁殖具有重要作用。然而，竹子根茎发育系统的转录后调控机制尚未得到全面研究。

研究材料

• 五个组织的总RNA：地下根的茎尖、根茎的侧芽、新芽尖、根和叶。

• 3个文库：1-2kb，2-3kb和大于3kb。

图1 毛竹全长转录组的取样组织

研究思路

这是一篇典型的三代全长转录组文章，主要应用得到的全长转录组数据发现新基因、优化之前的基因注释结果、鉴定可变剪接事件和可变多聚腺苷化事件。

研究结果

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全长转录组数据

该研究使用PacBio RSII测序系统进行了七个SMRT cell的测序，产生了来自三个文库的122787、116762和48763个插入片段（ROI），超过50％（147,362）的ROI是全长非嵌合体的reads（FLNC reads）。为了避免并纠正三代测序数据的高错误率，作者使用了Illumina数据校正单分子长reads，共获得了146225个错误校正的FLNC reads。这些FLNC reads覆盖了52％的注释基因，11902个基因至少由两个PacBio reads支持。

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错误注释基因纠正

将FLNC reads与毛竹基因组的注释进行比较，揭示了一些相邻的注释基因与单个连续的FLNC reads重叠，这被认为是错误注释的基因（图2a）。共检测到2241个基因被错误地注释为多个分裂的基因，根据FLNC reads将其合并到1092个新的基因座中。用错误注释的2个分裂基因两端设计引物进行RT-PCR，结果与基于FLNC reads的结果一致（图2b）。

图2 错误注释的分裂基因来自同一基因位点

鉴于错误注释的分裂基因源自相同的基因座，它们在相同的启动子控制下应具有相似的表达谱。与这个假设一致，每对错误注释的分裂基因之间具有强烈的正相关，这说明它们确实源于一个基因座（图3）。与其他基因相比，错误注释的分裂基因更长，使得使用二代测序技术的转录组更难以组装（图3）。

图3 错误注释的分裂基因具有相似的表达模式和较长的基因长度

3

发现新转录本

评估了毛竹基因组中基因注释的完整性，发现35447个FLNC reads与任何注释区域都没有重叠，说明这些未注释的转录本可能来自新的基因座。这些FLNC reads被合并到8,091个基因位点，RT-PCR能够基于FLNC reads证实它们的存在，这说明它们是真正的基因座（图4a）。这些新发现的基因座表达水平普遍较低，这可能是为什么这些转录本在之前的研究中未被注释的原因之一（图4b）。

图4 新转录本的证实及低表达量

与其他转录物相比，这些新颖的转录本显示出较少的内含子数目（图5）。共有1,989个位点与植物LncRNA数据库显示同源性，说明这些新基因座中的一部分来源于非编码区。这些新基因座的聚类分析表明，它们表现出组织特异性表达模式，也可能是以前没有鉴定到的另一个原因（图5）。由于FLNC reads的优点，全长转录组在鉴定新基因座方面是可靠的。

图5 新转录本的内含子与表达聚类

4

鉴定可变剪接

共获得128,667个含有内含子的FLNC reads，代表42,280个全长剪接异构体。9,848个基因检测到多个AS类型，表明可以使用全长转录组来识别AS类型的复杂性。将11,306个AS事件分为四种不同类型：6,300个内含子保留型，1,427个可选择的5'供体，2,902个可选择的3'供体和677个外显子跳跃事件，内含子保留是AS事件中数量最多的。

AS基因显示比非AS基因表达具有更高的丰度（图6）。AS具有高的组织特异性，结合Illumina测序数据分别成对比较根茎尖、新芽尖和侧芽来定量差异剪接事件，确定了820、503和729个差异表达AS事件。对于新芽和侧芽的成对比较，差异剪接基因主要表现为RNA 3'末端的变异，表明在新芽快速生长期间与侧芽相比，AS可能参与3'末端的调控。

图6 可变剪接基因的差异表达

5

鉴定可变多聚腺苷酸

该研究从11,450个基因中鉴定了25,069个多聚腺苷酸化位点，其中6,311个具有两个或多个聚腺苷酸化位点的基因，可变多聚腺苷酸事件（APA）通过RT-PCR和3'快速扩增的DNA端（3'RACE）进行验证。APA基因的长度和表达水平与poly（A）位点数相关。竹基因组中共有19个纤维素合酶（CesA）和38个纤维素合成酶相似基因（CsI）基因，其中11个CesA，11个Csl和两个木质素基因由APA调控，说明APA可能参与调节细胞壁结构和次生细胞壁的形成。

发生多聚腺苷酸化基因的内含子普遍较长（图7）， Gypsy和Copia是内含子多腺苷酸化区域内的两个主要转座子，它们可能调节内含子的异染色质状态，从而影响多聚腺苷酸化位点的选择。此外，该研究还开发了poly（A）的定量方法，以此鉴定了根茎系统中数百个差异poly（A）位点。

图7 APA基因的内含子长度及其TE含量

总结

该研究使用三代Pacbio测序技术对竹子基因组进行补充注释，并鉴定根茎中的可变剪接（AS）和可变多聚腺苷酸化（APA）事件。校正了2,241个错误注释的基因，并鉴定了8,091个之前基因组未注释的基因，鉴定了42,280个全长剪接isoform，涉及与根茎系统相关的大量AS事件。从11,450个基因中鉴定了25,069个多聚腺苷酸化位点，其中6,311个具有APA位点。发生多聚腺苷酸化基因的内含子普遍较长，Gypsy和Copia是内含子多腺苷酸化区域内的两种主要转座子。这些结果表明，三代全长转录组在研究转录后调控方面具有重要的作用。

参考文献：

【１】Wang T, Wang H, Cai D, et al. Comprehensive profiling of rhizome-associated alternative splicing and alternative polyadenylation in moso bamboo (Phyllostachys edulis).[J]. The Plant Journal, 2017.