如何从组学角度设计进阶实验？

又或者，刚进实验室的师弟师妹们要接过师兄师姐的研究课题，继续研究下去。怎么破？课题“看似”已经结束了，还能继续研究下去吗？

其实，我们手头上的课题只是实验室大课题的其中一小部分，我们发表的文章也只是解开了其中一小个谜团而已，真正的科学问题可不是一篇SCI文章就能够完整解决的！我们需要想得更深、做得更深。那么，可以从哪些方面扩宽研究的深度和广度呢？

比如从组学角度出发。生物体内含有多种多样的调控因子，包括转录因子、小RNA、lncRNA、代谢物、DNA甲基化、组蛋白修饰等，这些调控因子在多个组学水平上都有可能对同一个生物学问题产生调控作用；同时，这些调控因子之间又可能会相互作用，也就是说多组学之间是相互补充相互调控的。

拿植物体内磷元素平衡（Pi homeostasis）这个例子来说明。磷是植物生长发育必需的一种重要营养元素，植物在缺磷时会产生应激反应，表现出mass减少、叶片枯黄等现象。但在恢复磷元素的供给时，这些现象又可以恢复过来。磷元素平衡的调控涉及到转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平、以及表观调控，目前在各个组学水平上都已经发表了不少研究成果。因此，要研究磷平衡的维持调控机制，就可以从这么多个方面入手，从而得到不一样的结果，相互验证与补充。

下面我们通过两篇分别利用不同组学研究水稻中磷元素平衡的SCI文章，来深入说明这条研究思路。这两篇文章都出自同一个课题组，2013年发表在The Plant Cell上的文章是利用RNA-seq从转录水平上来研究的；2015年发表在eLIFE上的文章是利用全基因组甲基化测序从DNA甲基化水平上来研究的，两个组学的研究结果相互补充，更深入地解释了磷平衡的维持调控机制。

第一篇文章-转录水平

为了研究水稻在磷饥饿早期、晚期以及磷恢复过程中的转录调控机制，对水稻根和芽分别进行磷饥饿处理1h, 6h, 24h, 3d, 7d和21d，然后在21d时对其中一半的样本进行磷恢复1h, 6h, 24h，另一半样本继续磷饥饿。

对这共126个样本进行RNA-seq测序，差异基因表达分析发现，磷饥饿早期和中期（3d及之前），差异表达基因很少，说明机体还没有开始应答；在磷饥饿晚期（7d后）机体开始响应，差异表达基因急剧增加（图1）。

接着对这些差异基因进行趋势分析，研究在磷饥饿与恢复过程中的基因表达模式。趋势分析的结果把这些差异基因分成了8个模块，其中class1和class4中的基因既响应磷饥饿，也响应磷恢复，所以很可能参与了机体内磷元素平衡的调节。

这些响应基因在磷恢复短时间内就回复到正常表达水平，如class1中的270个上调基因在恢复磷供给后1h就回复到正常表达水平，这些基因包括一些在磷平衡中起着关键作用的基因，如磷转运蛋白PT、SPX、参与脂类代谢的MGD2基因等（图2）。

图1 基因差异表达结果

图2根和芽响应磷饥饿的基因表达模式

第二篇文章-DNA甲基化水平

从转录组水平上阐明了水稻根和芽响应磷饥饿的调控机制后，那么，磷饥饿对DNA甲基化水平有没有影响呢？为了研究DNA甲基化在环境应激时的变化模式，该课题组采取了与上一篇文章相似的实验设计，也是研究水稻根和芽在磷饥饿与恢复过程中的DNA甲基化变化模式。稍微不同的是，这篇文章还设置了短期磷恢复（21+1d，21+3d）与长期磷恢复（21+31d）的比较。

首先对这些样本进行RNA-seq研究转录组层面的变化，结果与上一篇文章的结果类似，也是磷饥饿7d后机体开始响应，差异基因的数目和差异倍数随着磷饥饿时间的延长不断增加；在磷恢复1d后，40%的差异基因表达水平就回复到了正常状态，磷恢复3d后，80%的差异基因表达水平就回复到了正常状态（图3）。

图3 转录组研究结果

然后对样本进行全基因组甲基化测序（WGBS），共得到175个差异甲基化区域（DMR），其中84%的DMR高甲基化。与转录本水平的变化相似，DNA甲基化水平的变化随着磷饥饿时间的延长而越来越显著。与转录本水平变化在磷恢复3天后就大部分回复正常不同，磷饥饿导致的DNA甲基化水平变化在磷恢复3天后继续维持，在磷恢复31天后才渐渐趋向正常（图4 A），这说明营养元素缺乏导致的差异甲基化状态可以维持较长一段时间，即使是恢复到正常的营养状态。

研究这些DMR在基因组中的位置，发现与水稻基因组中90%的转座子区域（TE）重叠（图4 C）。

对DMR相关基因进行分析，发现95%表达量上调，并且与磷平衡功能相关，如磷酸转运蛋白PT、SPX基因、MGD2、IPS2等（图4 E）。

图4 磷饥饿引起的DNA甲基化变化

对这些DMR的甲基化类型进行研究，发现绝大部分都是CHH类型，并且几乎与TE区重叠（图5）。

图5 甲基化类型

既然磷饥饿引起的DNA甲基化绝大部分都是CHH类型，并且几乎与TE区重叠，那么很自然地就会猜测这种DNA甲基化是不是通过经典的RdDM途径形成的。因此作者利用DCL3a敲除系研究磷饥饿导致的DNA甲基化，发现DCL3a敲除后对甲基化的结果并没有太大的影响（图6），这说明了磷饥饿引起的DNA甲基化很可能是通过其他的不需要DCL3a的途径形成的，如RDR6-RdDM途径。但作者后续没有再进行实验验证，而是只停留于猜测。如果把这部分的实验补上了，估计可以冲10分。

图6 DCL3a敲除实验结果

综合以上结果，作者总结出DNA甲基化在水稻磷饥饿胁迫中的作用机制和模式：在短时间的磷饥饿中，RNA聚合酶Ⅱ聚集到磷饥饿响应基因（PSI gene）的启动子上，诱导PSI基因表达。这些RNA聚合酶Ⅱ同样能够诱导PSI基因附近的转座子TE的转录，从而对细胞产生不利影响。因此，随着磷饥饿时间的延长，在这些大量表达的PSI基因附近的转座子通过一种DCL3a非依赖的途径被甲基化，从而阻止了TE的转录，防止对细胞基因组产生不利影响（图7）。

图7 磷饥饿胁迫引起的DNA甲基化模式

读完这两篇文章，大家是不是对磷平衡的维持调控机制有了更深入的了解？不同组学可以从不同的角度去解释同一个生物学现象，从而使得我们的研究更完整。不同组学之间也可以相互作用与解释，如miRNA调控mRNA的表达、组蛋白修饰影响DNA甲基化等等，利用不同的组学，可以解释我们利用上一个组学研究而产生的新问题。具体怎么应用？还有哪些进阶实验的设计思路？

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