浅谈CRISPR/Cas9原理及优势

大家看到CRISPR/Cas9，一定会感到非常熟悉，没错，从2013年以来 ，CRISPR/Cas9技术大热，其凭借绝妙的Knock out效果，迅速风靡科研界。今天，我们就针对CRISPR/Cas9技术的原理及其优势进行讲解。

一．CRISPR/Cas9技术背景及原理

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats）规律成簇间隔短回文重复；Cas9（CRISPRassociated nuclease）是CRISPR相关核酸酶，CCRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。

CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这些生物体中，来自噬菌体的外源遗传物质获得和整合入CRISPR位点。这些序列特异的片段被转录成短CRISPR的RNA（CRISPR-derivedRNA），crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，然后tracrRNA/crRNA复合体指导Cas9蛋白切断双链DNA。

一旦crRNA结合到Cas9，Cas9核酸酶的构象发生改变，产生一条能通道，让DNA更容易结合。Cas9/crRNA复合体能够识别PAM(5'-NGG)位点导致DNA解旋，使crRNA找到PAM位点相邻的DNA互补链。当Cas9结合到PAM位点相邻的，与crRNA互补的DNA序列上，REC叶内部的桥螺旋和靶DNA形成RNA-DNA 异源双链结构。PAM位点的识别包括可使靶DNA双链断裂(DSB)的HNH和RuvC核断裂的激活，导致DNA降解。如果crRNA与靶DNA不互补，Cas9将会释放出来，寻找新的PAM位点。DNA中的线性靶基因组断裂后可以通过非同源末端接合(NHEJ)或者同源介导的修复(HDR)来进行修复，而非同源末端接合(NHEJ)会引起插入或者删除错误，从而达到定点敲除某种基因的目的。

在利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA（sgRNA）表达同样可以起到靶向剪切的作用。因此现在我们用的CRISPR/Cas9工具只有Cas9核酸酶和gRNA两部分。应用此工具，我们可以非常方便快捷的进行任意基因的编辑改造，比如基因敲除，敲入，定点突变等等。CRISPR/Cas9机制可用于包括哺乳动物细胞在内的各种系统的基因工程中,如下图所示。

CRISPR/Cas9的成功与否的关键问题在于gRNA的设计，gRNA和非目标区域过多的非特异性结果，脱靶效率较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前为了提高基因组编辑的准确性，对Cas9核酸酶进行了突变，突变后的Cas9只能切割DNA双链中的一条链，通过两个gRNA引导Cas9对DNA切割，可以显著提高基因组编辑的特异性，降低脱靶效应。

二．CRISPR/Cas9系统介绍

目前CRISPR/Cas9的载体主要有两种【参考文献：Improved vectors and genome-widelibraries for CRISPR screening】：

1. Single-vector lentiviral GeCKO system

2. Dual-vector lentiviral GeCKO system

第一种lentiCas9-Blast和lentiGuide-puro，这个系统包含两个质粒，

lentiCas9-Blast编码Cas9蛋白，lentiGuide-puro转录sgRNA，如下图所示：

第二种lentiCRISPRv2直接将Cas9和sgRNA整合到一个质粒当中，进行表

达，如下图所示：

三．GeCKO library简介：

2013年，来自麻省理工学院，哈佛医学院，Broad研究院等处的研究人员，青年华人学者张峰助理教授完成了人类细胞全基因组范围内CRISPR-Cas9敲除筛选，这对于CRISPR-Cas9技术的发展具有重要意义。这一研究成果公布在2013年12月13日《Science》杂志上。作者通过用慢病毒载体构建CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文库，在基因组范围内，能靶向18080个基因（64,751个独特靶向序列）进行敲除。此项技术立即用于药物的靶点筛选，并再新药筛选中，取得喜人的突破。现在发展起来的GeCKO v2.0 library的具体介绍如下表所示：

研究人员先利用GeCKO文库鉴定了对癌症和多能干细胞细胞活力必不可少的基因，其次他们还在一个黑素瘤模型中，筛选出了涉及药物维罗非尼（Vemurafenib）耐药性的基因。从中研究人员筛选出了多个有效的基因，比如之前曾发现的NF1和MED12，以及未曾发现过的NF2，CUL3，TADA2B和TADA1 。作者指出靶向同一基因的独立导向RNAs之间存在高度的一致性和高命中确认率，这对于Cas9基因组范围内筛选具有重要意义。其具体操作过程如下所示：

四．全基因组水平筛选方法对比：

目前关于全基因组敲减和敲除的方法主要有以下几种：

siRNA全基因组筛选方法

ShRNA全基因组筛选方法

CRISPR/Cas9全基因组敲除筛选方法

接下来我们将针对各个方法的优缺点进行解析：

siRNA library：

siRNA为人工合成的短RNA片段, 只能在96孔或384孔等培养板中进行彼此独立的表型筛选；或者直接利用商品化的siRNA文库，每种siRNA都有自己特异性的bar code（条形码），实验过程中通过检测条形码的量，来确定哪种siRNA发挥了作用，如下图所示：本篇文章作者直接利用带有bar code的siRNA文库进行大规模筛选之后找出了以下变化明显的基因，参考文献【Mutant IDH inhibits HNF-4ato block hepatocyte differentiation and promote biliary cancer】：

shRNA library：

shRNA需要通过表达载体实现作用, 因此可以构建到慢病毒等载体上通过 病毒侵染方式进行混合型文库筛选, 再通过微阵列芯片(microarray)或者深度测序(deep sequencing) 技术对筛选后富集的shRNA进行解码和分析。 混合型shRNA文库筛选具有简便、经济、高效等特点, 逐渐成为RNAi文库筛选的主流方案。利用RNA 干扰鉴定高等生物基因功能的技术虽然已经普及, 甚至被应用于高通量、全基因组规模的功能性筛选中, 但是由于RNA干扰不能完全抑制基因表达, 常常不足以造成稳定的表型变化, 从而影响对基因功能的正确判断。另外, RNA干扰经常伴随脱靶现象, 其基因回补验证的过程也非常繁琐复杂, 使用起来不尽如人意，如下图所示：

较之于siRNA文库和shRNA文库的knockdown, CRISPR-Cas9文库通过靶向基因的敲除konck out制造表型变化, 可以使用更加严苛的筛选标准, 更有效地去除假阳性; 而且有着成本低廉、构建简单、操作方便等优点。

综上所述，CRISPR/Cas9技术的优势已经显而易见，现在许多实验室，公司及临床项目已经开始对CRISPR/Cas9技术进行应用，比如：利用其进行信号通路相关基因的寻找，药物靶点筛选，药物原发性研究以及基因治疗等，可以预见CRISPR/Cas9技术在未来几年将继续飞速进步，我们也有理由相信，它将会给我们带来越来越多的惊喜！