piRNA：一类可能会火起来的非编码RNA

piRNA（PIWI-interacting RNA），是一种长25～33nt的非编码RNA，通过与PIWI蛋白相互作用而发挥作用，虽然同为非编码RNA，piRNA却远没有miRNA、LncRNA、circRNA知名度高，主要是因为piRNA主要在生殖系统中表达，相关研究也大多集中于此。

最近piRNA相关的研究逐渐增多，piRNA研究工作登上CNS的次数比最近大热的circRNA还要多得多。piRNA与基因组稳定性保持、表观遗传学调节、生殖干细胞分化、胚胎发育和多种疾病的发生、发展密切相关。

PIWI蛋白在如精原细胞瘤、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、胶质瘤等，可能充当着致癌因子或抑癌因子。

piR-651、piR-4987、piR-20365、piR-20485和piR-20582在乳腺癌中明显高表达；piR-823在胃癌中表达降低，piRDQ594040在膀胱癌中异常高表达等等。

我们先来看一项近期登上Cell杂志的piRNA研究。

以下内容经BioArt授权转载

piRNA是近年来在动物生殖细胞中发现的一类非编码小分子RNA，它可以与PIWI蛋白相互结合形成PIWI/piRNA“机器”，在动物生殖细胞发育分化过程中发挥重要作用。2013年刘默芳课题组就已经发现了小鼠piRNA在精子形成后期触发其结合蛋白PIWI（MIWI）经APC/C-泛素化降解的新途径和piRNA诱导PIWI降解的新功能，为精子形成异常导致的男性不育症发生提供了潜在的分子信息。那么PIWI突变是否会导致雄性不育，更准确的说人类不育症患者中是否存在PIWI突变？5月25日，来自中科院生化与细胞所的刘默芳研究组和上海计划生育科学研究所施惠娟研究组合作在Cell上发表了题为“Ubiquitination-Deficient Mutations in Human Piwi Cause Male Infertility by Impairing Histoneto-Protamine Exchange during Spermiogenesis”的研究论文，该研究首次发现了PIWI蛋白突变致男性不育并深入揭示了相关的致病机理，还发现了在精子变形过程中引发组蛋白-鱼精蛋白转换的新机制，为相关男性不育症的精准医疗提供了理论基础和方法策略。

论文解读：

piRNA是近年来在动物生殖细胞中发现的一类非编码小分子RNA。2006年，有4个独立的课题组几乎在同一时间报道了一类与PIWI家族蛋白相互作用的小分子RNA，长度约为24~32 nt，因为与PIWI蛋白相互作用，故称为PIWI-interacting RNA，简称piRNA。值得一提的是四篇论文中，其中一篇文章是来自耶鲁大学林海帆教授实验室（相关工作是在杜克大学任职期间完成的）【1-4】。

piRNA起源于基因组中的反转座子、重复序列及一些被称为piRNA簇的区域，piRNA与PIWI蛋白相互结合形成PIWI/piRNA“机器”，可以通过在表观遗传水平和转录后水平沉默转座子、反转座子等移动元件，维持生殖细胞自身基因组的稳定性和完整性，在配子形成过程中发挥重要作用。刘默芳实验室及其他国际同行实验室最近的研究显示，PIWI/piRNA机器也参与调控生殖细胞中编码基因的表达。对PIWI/piRNA“机器” 生物学功能及意义的研究，可以为相关男性不育症的诊断和治疗提供理论基础，具有十分重要的意义【5】。

生殖细胞特异性表达的PIWI家族蛋白是piRNA作用途径的中心，是piRNA的生成及功能所必需。小鼠PIWI家族包括MILI、MIWI和MIWI2三个成员，特异性地在睾丸中表达，对小鼠精子发生至关重要。

刘默芳研究组近年来围绕“piRNA在哺乳动物精子发生中的功能和机制”方面做了大量系统的研究，取得了多项重要成果。这些成果包括，发现piRNA通过泛素-蛋白酶体途径调控其结合蛋白MIWI及自身的降解代谢，并首次揭示了PIWI/piRNA的代谢调控机制以及piRNA调控泛素化途径的新功能(Dev Cell 2013)； 小鼠粗线期piRNA指导父本mRNA在精子形成后期大规模降解(Cell Res 2014)；发现了小鼠piRNA可直接介导部分睾丸mRNA的切割，揭示了piRNA可在小鼠睾丸组织中发挥siRNA类似的功能，而且该功能为雄性生殖细胞发育成熟所必需（Cell Res 2015）。值得一提的是，有关MIWI的代谢异常造成精子细胞发育受阻的研究，为精子形成异常导致的男性不育症发生提供了潜在的分子信息。

2013年刘默芳研究员课题组与王恩多院士课题组合作在Dev Cell杂志上揭示了piRNA通过泛素-蛋白酶小体途径调控其结合蛋白MIWI及自身的降解代谢，并首次揭示了PIWI/piRNA的代谢调控机制以及piRNA调控泛素化途径的新功能

而刘默芳研究组这篇最新的Cell论文在此前相关研究的基础之上，发现了无精/少弱精症患者存在拮抗人PIWI（HIWI）泛素修饰的基因突变，通过小鼠模型证明此类突变导致雄性不育，并深入揭示了其致病的分子机制。

此前在许多研究PIWI的动物模型中都证明了PIWI对生殖细胞发育的分化的重要作用，然而PIWI在人类生殖细胞发育分化中的功能并不清楚。那么作者首先提出的科学问题就是，PIWI在人类生殖细胞形成中具有什么作用？人类不育患者中是否存在PIWI突变？为了回答上述问题，作者首先检测了413例无精症患者（300例健康人群作为对照）Piwi基因（人类中又称为Hiwi）上一个在脊椎动物中十分保守的D-Box序列中是否存在突变。测序结果显示，该课题组非常幸运地发现了3例无精症患者身上存在Piwi D-Box突变（下图）。生化实验检测发现这类突变导致了PIWI蛋白泛素化缺陷，但是不影响PIWI对靶RNA分子的切割作用以及piRNA-loading的功能。

图为测序检测到的3例无精症患者身上存在Piwi D-Box突变

为了进一步验证确实是Piwi D-Box突变是否确实可以导致的男性不育症的发生，那么接下来就很有必要构建条件性Piwi D-Box突变knock-in小鼠模型，小鼠模型显示条件性Piwi D-Box knock-in突变后，小鼠出现雄性不育、精子形态异常以及细胞核结构疏松（下图）。随后通过质谱检测发现，条件性Piwi D-Box knock-in小鼠精子中还存在多种蛋白异常表达。

图为正常雄性小鼠精子和Piwi D-Box knock-in小鼠精子形态上的差异

了解精子发育过程的人们应该知道，精子发育在结构特化的过程中会发生“组蛋白-鱼精蛋白转换（Histone-to-Protamine exchange）”（下图）。

2010年，Dev Cell杂志报道了RNF8介导的组蛋白泛素化启动了精子变形过程中的“组蛋白-鱼精蛋白转换”（下图）。

有了上述研究背景，作者马上就想到检测小鼠精子中组蛋白泛素化修饰是否发生了变化。果然，条件性Piwi D-Box knock-in小鼠的后期精子细胞中组蛋白泛素化水平显著下降（下图）。

Piwi D-Box knock-in小鼠精子中组蛋白H2B泛素化水平大幅下降

然而上述这个过程中的分子机制又是什么呢？随后的生化实验表明，MIWI（PIWI）可以与RNF8相互作用，抑制了RNF8入核泛素化组蛋白。Piwi D-Box突变不仅导致MIWI突变体蛋白在细胞质中的累积，而且抑制了RNF8泛素连接酶入核，从而影响精子发生过程中组蛋白的泛素化以及进一步的“组蛋白-鱼精蛋白替换”过程。进一步实验表明RNF8-N（N端1-210aa）足以竞争RNF8全长蛋白和MIWI的结合作用。好玩的是，在Piwi D-Box突变的精子中过表达RNF8-N可以rescue精子的活力（下图）。

总的来说，这项研究的重要意义在于首次发现人类Piwi基因突变可导致男性不育，深入揭示了其致病机理，并为相关男性不育症的精准医疗提供了理论基础和方法策略。

工作模型

参考文献：

1、Aravin, A., Gaidatzis, D., Pfeffer, S., Lagos-Quintana, M., Landgraf, P., Iovino, N., ... & Chien, M. (2006). A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. Nature, 442(7099), 203-207.

2、Girard, A., Sachidanandam, R., Hannon, G. J., & Carmell, M. A. (2006). A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins. Nature, 442(7099), 199-202.

3、Grivna, S. T., Beyret, E., Wang, Z., & Lin, H. (2006). A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cells. Genes & development, 20(13), 1709-1714.

4、Watanabe, T., Takeda, A., Tsukiyama, T., Mise, K., Okuno, T., Sasaki, H., ... & Imai, H. (2006). Identification and characterization of two novel classes of small RNAs in the mouse germline: retrotransposon-derived siRNAs in oocytes and germline small RNAs in testes. Genes & development, 20(13), 1732-1743.

5、戴鹏, 苟兰涛, & 刘默芳. (2014). PIWI/piRNA “机器” 与雄性生殖细胞发育. 生命的化学, 34(004), 456-465.