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软件作者介绍 陈实富博士，海普洛斯联合创始人 / CTO 海普洛斯是全球领先的精准医疗和基因大数据国家高新技术企业，拥有 Illumina NovaSeq、 HiSeq X10、NextSeq等全系列测序仪，致力于整合液体活检、基因测序、人工智能、大数据等前沿新兴科技，让每一个生命健康 120 年。海普洛斯拥有很好的开源文化，发起和维护了开源基因数据分析项目组 OpenGene。 目前，陈博士正在招聘生物信息攻城狮(文末附招聘需求)，如果你有兴趣加入这个开放而富有情怀的团队，请加他的微信(WeChat ID：opengene)，或者直接将简历砸向 chen@haplox.com。
第一部分 引言 各位做生信的小伙伴都知道，对于下机的 FASTQ 数据需要进行质控和预处理，以保证下游分析输入的数据都是干净可靠的。通常我们都是使用 FASTQC 等软件进行质控，使用 cutadapt 软件去除接头，使用Trimmomatic 等软件进行剪裁，然后使用一些自已开发的脚本进行过滤。这一过程可能需要使用多个软件，相当繁琐，而且速度较慢，这些软件大多又不支持多线程，遇到较大的FASTQ 文件，处理起来可真是让人等得心急如焚。
所以今天给大家介绍一款新的软件：fastp。它可以仅仅扫描 FASTQ 文件一次，就完成比FASTQC + cutadapt + Trimmomatic 这三个软件加起来还多很多的功能，而且速度上比仅仅使用 Trimmomatic 一个软件还要快 3 倍左右，因为它使用 C++开发，处处使用了高效算法，而且完美支持多线程！正因为其强大的功能和飞快的速度，其 github 项目在第一个版本发布至今才一个月左右,就已经收到了50 多个 star，这在生信软件小领域里面算是神速了！而且该软件更新频繁，至今已发布了 14 版，每一版都有新功能加入！ 该项目的 github 地址请戳： https://github.com/OpenGene/fastp
第二部分 功能特点 先来看一看该软件的功能列表： fastp软件十大功能列表 1、对数据自动进行全方位质控，生成人性化的报告； 2、过滤功能(低质量,太短,太多N......)； 3、对每一个序列的头部或尾部，计算滑动窗内的质量均值，并将均值较低的子序列进行切除(类似 Trimmomatic 的做法,但是快非常多)； 4、全局剪裁 (在头/尾部，不影响去重)，对于 Illumina 下机数据往往最后一到两个 cycle 需要这样处理； 5、去除接头污染。厉害的是，你不用输入接头序列，因为算法会自动识别接头序列并进行剪裁； 6、对于双端测序(PE)的数据，软件会自动查找每一对read的重叠区域，并对该重叠区域中不匹配的碱基对进行校正； 7、去除尾部的 polyG。对于NextSeq/NovaSeq 的测序数据，因为是两色法发光，polyG 是常有的事，所以该特性对该两类测序平台默认打开； 8、对于PE数据中的overlap区间中不一致的碱基对，依据质量值进行校正； 9、可以对带分子标签(UMI)的数据进行预处理，不管UMI在插入片段还是在index 上，都可以轻松处理； 10、可以将输出进行分拆，而且支持两种模式，分别是指定分拆的个数，或者分拆后每个文件的行数。 以上功能大多都不需要输入太多的参数，一些功能默认已经开启，但是可以用参数关闭。fastp 完美支持 gzip 的输入和输出，同时支持 SE 和 PE 数据，而且不但支持像 Illumina 平台的 short read 数据，也在一定程度上支持PacBio与Nanopore 的 long reads 数据。
fastp 软件会生成 HTML 格式的报告，而且该报告中没有任何一张静态图片，所有的图表都是使用 JavaScript 动态绘制，非常具有交互性，想要看一下样板报告的，可以去以下链接：http:///fastp/fastp.html
而且软件的开发者还充分考虑到了各种自动化分析的需求，不但生成了人可读的HTML 报告，还生成了程序可读性非常强的 JSON 结果，该 JSON 报告中的数据包含了 HTML 报告 100%的信息，而且该 JSON 文件的格式还是特殊定制的，不但程序读得爽，你用任何一款文本编辑器打开，一眼过去也会看得明明白白。想要看一下 JSON 结果长什么样的，可以去以下链接:http:///fastp/fastp.json
第三部分 轻松上手
看起来这个软件功能非常多，那使用起来是不是非常复杂呢？非也！ 该软件的使用非常简单，默认情况下只需要指定输入和输出文件，就可以很好地工作。例如我们想对 in.fq 文件进行过滤和质控，并输出 clean data 为 out.fq，那么就可以使用以下的命令:
fastp -i in.fq -o out.fq 即使用小写的 i 和小写的 o 分别指定 input 和 output 文件，就大功告成啦。软件执行完成之后，会生成 out.fq，还会生成两个文件 fastp.html 和 fastp.json。其中fastp.html 是可视化的 QC 质控报告以及各类过滤统计，而 fastp.json 是 JSON 版本的报告，主要用于下游程序来解读质控和过滤的结果。而且 fastp 会同时统计过滤前(raw data)和过滤后(clean data)的质量信息，以方便你分析过滤前后数据质量发生了什么变化，够贴心吧？以上例子是对单端测序数据(single-end,SE)进行的，那对于双端测序数据(paired-end,PE)是不是也可以呢？答案自然是肯定的，而且命令也基本上差不多，示例如下：
fastp -i in.R1.fq -o out.R1.fq -I in.R2.fq -O out.R2.fq
可以看到，-i 和-o 还是用来指定 read1 的输入了输出，而大写的-I 和-O(注意是喔,而不是零)则是用于指定read2的输入和输出，其他都保持不变。而且fastp软件最初的研发就是为了更好地处理 PE 数据，所以对于 PE 数据开发了更多的算法，比如基于 overlap 分析进行碱基校正等功能，就是只有 PE 数据独享的。fastp 对于输入和输出都支持 gzip 压缩，使用方法也很简单，只要文件名的末尾带有.gz，就会被认为是 gzip 压缩文件，会启用 gzip 对输入输出进行压缩和解压处理，例如以上 PE 的例子，如果是压缩的，就可以是以下命令：
fastp -i in.R1.fq.gz -I in.R2.fq.gz -o out.R1.fq.gz -O out.R2.fq.gz 第四部分 安装fastp
安装 fastp 十分简单，如果你使用的是 Linux 系统，可以直接使用网站上供的预编译好的版本，下载地址是 http:///fastp/fastp，可以使用 wget等命令进行下载，下载了之后记得使用 chmod a+x ./fastp 增加该文件的可执行权限，然后就可以使用了。
也可以从源代码进行编译，需要使用 git 工具或者直接在网页上下载 release 的源代码，以 git 下载最新的代码为例： cd fastp make sudo make install
第五部分 功能介绍 接下来我们简单介绍一下 fastp 的一些功能，受公众号篇幅影响，每一个功能我们都只是简单地带过，如果想要看详细的介绍，可以上 github 官网上查看。 5.1 过滤
对于低质量序列，较多 N 的序列，该功能默认是启用的，但可以使用-Q参数关闭。使用-q 参数来指定合格的 phred 质量值，比如-q 15 表示质量值大于等于Q15 的即为合格，然后使用-u 参数来指定最多可以有多少百分比的质量不合格碱基。比如-q 15 -u 40 表示一个 read 最多只能有 40%的碱基的质量值低于Q15，否则会被扔掉。使用-n 可以限定一个 read 中最多能有多少个 N。
fastp 还默认启用了 read 长度过滤，但也可以使用-L 参数关闭。使用-l 参数指定最低要求一个 read 有多长，比如-l 30 表示低于 30 个碱基的 read 会被扔掉。这个功能可以用于实现常用的 discard 模式，以保证所有输出的序列都一样长。
5.2 接头处理 接头(adapter)污染的处理是 FASTQ 文件预处理中很重要的一步。fastp 默认启用了接头处理，但是可以使用-A 命令来关掉。fastp 可以自动化地查找接头序列并进行剪裁，也就是说你可以不输入任何的接头序列，fastp 全自动搞定了！对于 SE 数据，你还是可以-a 参数来输入你的接头，而对于 PE 数据则完全没有必要，fastp 基于PE 数据的 overlap 分析可以更准确地查找接头，去得更干净，而且对于一些接头本身就有碱基不匹配情况处理得更好。fastp 对于接头去除会有一个汇总的报告，如下图所示： 5.3 滑窗质量裁剪 很多时候，一个 read 的低质量序列都是集中在 read 的末端，也有少部分是在 read的开头。fastp 支持像 Trimmomatic 那样对滑动窗口中的碱基计算平均质量值，然后将不符合的滑窗直接剪裁掉。使用-5 参数开启在 5’端，也就是 read 的开头的剪裁，使用-3 参数开启在 3’端，也就是 read 末尾的剪裁。使用-W 参数指定滑动窗大小，默认是 4，使用-M 参数指定要求的平均质量值，默认是 20，也就是 Q20。
5.4 PE 数据的碱基校正
fastp 支持对 PE 数据的每一对 read 进行分析，查找它们的 overlap 区间，然后对于 overlap 区间中不一致的碱基，如果发现其中一个质量非常高，而另一个非常低，则可以将非常低质量的碱基改为相应的非常高质量值的碱基值，如下图所示： 上图中所示的标红的 T 碱基是低质量序列，和高质量的 A 不匹配，它会被校正为 A。该校正功能默认没有开启使用-c 参数可以启用，对于一些对噪声容忍度低的应用，比如液体活检，建议开启。
5.5 全局剪裁
fastp 可以对所有 read 在头部和尾部进行统一剪裁，该功能在去除一些测序质量不好的 cycle 比较有用，比如 151*2 的 PE 测序中，最后一个 cycle 通常质量是非常低的，需要剪裁掉。使用-f 和-t 分别指定 read1 的头部和尾部的剪裁，使用-F和-T 分别指定 read2 的头部和尾部的剪裁。
5.6 polyG 剪裁
对于两色发光法的 Illumina 设备(NextSeq / NovaSeq)，因为在没有光信号情况下 base calling 的结果会返回 G，所以在序列的尾端可能会出现较多的 polyG，需要被去除。fastp会自动化地识别NextSeq / NovaSeq的数据，然后进行polyG识别和剪裁。如果你想强制开启该功能，可以指定-g 参数，如果想强制关闭该功能，则可以指定-G 参数。
5.7 分子标签 UMI 处理
UMI 在处理 ctDNA 类似的超低频突变检测应用中是十分有用的，为了更好地对带 UMI 的 FASTQ 文件进行预处理，fastp 也很好地支持了 UMI 预处理功能。该功能默认没有启用，需要使用-U 参数开启，另外需要使用--umi_loc 来指定 UMI所在的位置，它可以是(index1、index2、read1、read2、per_index、per_read )中的一种，分别表示 UMI 是在 index 位置上，还是在插入片段中。如果指定了是在插入序列中，还需要使用 --umi_len 参数来指定 UMI 所占的碱基长度。
5.8 输出文件切分
很多时候我们需要对输出的 FASTQ 进行切分，分成大小均匀的多个文件，这样可以使用比对软件并行地比对，高并行处理的速度。fastp 软件也供了相应的功能，并且支持了两种模式，分别是使用参数-s 指定切分后文件的个数，或者使用-S 参数指定每个切分后文件的行数。
第六部分 质控报告解读
接下来，我们再看一下如何理解 fastp 生成的质控报告。 fastp 的报告在单一文件中同时包含了过滤前和过滤后的统计结果，如果是 PE 数据，则同时包含了 read1和 read2 的统计结果。之前我们已经说过了，fastp 会生成 HTML 的报告和 JSON格式的报告。HTML 报告的默认文件名是 fastp.html，但是可以通过-h 参数修改，JSON 报告的默认文件名是 fastp.json，但是可以通过-j 参数修改。而且 fastp 报告还有一个标题，默认是 fastp report，这个也可以通过-R 参数修改为你想要的标题。JSON 格式的报告是优化过的，人机皆可读，适合进阶的用户使用程序解析，而这里我们重点关注 HTML 格式的报告。
6.1 质量含量分布曲线
我们第一关注的当然是质量，所以 fastp 供了质量分布曲线，即每一个 cycle的平均质量值，而且 fastp 同时供了 A/T/C/G 四种不同碱基的平均质量，以及总的平均质量，如下图所示： 从上图我们可以看到，一共有 5 条曲线，分别是 A/T/C/G 和 mean。而且 HTML报告的每一个项目和分项目都是可以点击进行隐藏和展开的。
6.2 碱基含量分布曲线
和质量分布曲线类似，碱基含量分布曲线也是按照每一个 cycle 来的，显示了每一个位置的碱基含量。如下图所示： 从图中可以看到，fastp同时显示了A/T/C/G/N/GC 的每一个位置的比例和总的比例。而且如果你觉得头部那里比较乱看不清的话，可以用鼠标拉一个框，它就放大了。
6.3 KMER 统计表格
fastp 对 5 个碱基长度的所有组合的出现次数进行了统计，然后把它放在了一张表格中，表格的每一个元素为深背景白字，背景越深，则表示重复次数越多。这样，一眼望去，就可以发现有哪些异常的信息。 从上面的 KMER 表格中，我们可以发现，GGGGG 的颜色特别深，从鼠标移上去之后显示的信息中我们可以发现它的出现次数是平均次数的 12.8 倍，这是不正常的，因为 GGGGG 的正常倍数应该在 1 倍左右。幸好我们有 fastp，它可以过滤掉这种 polyG，让数值较多地回归正常。
6.4 过表达序列
fastp 的最新版本(v0.12)供了过表达序列（overrepresetned sequence ）的分析，而且不但供了这些 overrepresented sequence 的序列个数和占比，还供了他们在测序cycles 中的分布情况，这有利于分析各种问题。具体示例如下图所示: 第七部分 结语 好了，本次 fastp 的介绍就到此结束了。 |
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