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Schrödinger’s microbes: tools fordistinguishing the living from the dead in microbial ecosystems Microbiome, Aug 2017 Joanne B. Emerson, Rachel I. Adams, Clarisse M. Betancourt Román, Brandon Brooks, David A. Coil, Katherine Dahlhausen, Holly H. Ganz, Erica M. Hartmann, Tiffany Hsu, Nicholas B. Justice, Ivan G. Paulino Lima, Julia C.Luongo, Despoina S. Lymperopoulou, Cinta Gomez-Silvan, Brooke Rothschild-Mancinelli,Melike Balk, Curtis Huttenhower, Andreas Nocker, Parag Vaishampayan, and Lynn J. Rothschild 鉴定大中型生物的生死或许较为简单，鉴定微生物的生死却比较棘手。然而总有一些情形需要我们做出判断。因此，不同的学科学领域（如医学微生物学、环境健康评估、微生物生态学等）分别开发出了适合自身需求的鉴定方法。本文主要面向环境微生物研究人员，总结了环境微生物研究方面常用的鉴定方法，仔细剖析了各种方法的优劣，尤其是重点阐述了各种方法与下游平台的兼容性（如高通量测序及分析）。虽然各种方法的缺陷似乎和其优势一样明显，但也不要气馁；在需要的时候选择一种合适的方法，合理解释自己的结果，还是可以的。 图1. 微生物生死鉴定方法概览 如图1所示，目前已有的鉴定主要包括培养依赖型和培养非依赖型两大类。能够在固体或者液体培养基内生长可以说是活体微生物最好的证明了。但是培养失败也并不等于微生物就是死的，毕竟现在有那么多“活而不可培养（viable butnon-culturable）”的微生物。此时可能就需要培养非依赖型的鉴定方法了，这也是本文将要重点介绍的内容。
微生物染色技术是区别微生物存亡的主要方法之一。染色的基本原理是借助物理因素或者化学因素。物理因素主要是指细胞及细胞物质对染料的吸附、渗透作用等；化学因素主要是指根据细胞物质与染料发生化学反应。图2所示是基于膜的完整性染色的一种方法，被染色而发荧光的是活体微生物。 图3. PI（Propidium Iodide，碘化丙啶）染色示例 图3是PI染色的示意图。左侧是不加染色剂的情况，计数得到所有的微生物。右侧是加染色剂的情况，已经死亡或者即将凋亡的微生物由于细胞膜完整性差而被染色，计数得到死亡微生物。二者的差值，即为活体微生物的数量。 图4. 存活率PCR检测（荧光定量PCR结合EMA/PMA染色）示意图 基于PCR扩增检测微生物存亡的方法称为存活率PCR，如图4所示。左侧是不加染色剂的情况，得到总DNA。右侧是加染色剂的情况，染色剂与游离DNA或者死亡细胞内的DNA结合。光激活处理后，染色剂结合的DNA被降解（到不适宜扩增的长度），如此得到活体的DNA总量。DNA定量可以通过qPCR或DNA测序获得。 图5. 基于RNA的检测方法 基于RNA的检测方法也有诸多应用，如图5所示。因为转录过程可能是微生物在细胞水平应对环境刺激最先做出的反应，并且RNA的半衰期比DNA短，也许更能代表环境活体微生物的真实情况。 图6. 放射自显影技术 利用稳定同位素标记也是应用较多的一种方法（如图6所示），其原理是只有活体微生物可以通过代谢等过程吸收放射性同位素标记的代谢物。3H-TdR以及C14标记的亮氨酸目前已经被广泛使用。 图7. “假死”的微生物 上述方法的一个很大的缺陷就是，活体微生物可能会受到处理条件的干扰而表现出“假死”现象，造成结果的假阴性。如图7所示的实验对此进行了验证。左图，PI染色的E. coli细胞进行电穿孔处理发现92%的细胞死亡。而稀释培养的结果则发现实际上处理后死亡的微生物并没有那么多。因此，实际应用中，务必要合理平衡方法的适用性与结果的可解释度。 后记：翻到这篇文章最初非常激动，终于找到系统介绍微生物生死鉴定的综述了；看完却略略失望，每个方法的缺陷都和其优点一样突出，感觉无所适从；最后抛开文章本身去思考，终于释然，生死悠悠无定止，生命如此奇妙，岂是人工操作的小把戏所能诠释？有无尽未知，尽全力知之，解其一隅，怡然而乐，这或许就是生命科学的魅力所在吧。 |
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