12分钟视频，学会判断DNA测序质量好坏

“外显子组测序、全基因组测序、区域捕获测序，啥样的数据质量好？怎样避免产生不好的数据？”

“Duplicate reads是如何产生的？如何避免？”

“为什么回帖率低？”

听视频，记笔记：

从公司拿到的测序文件长啥样？

fastq文件长这样：

序列回帖前的质控

Q30、duplicate、GC content。其中重复序列比例Duplicates level

• Duplicated reads：指的是一模一样的序列，这些序列在DNA分析过程中很可能会被去掉；

• Duplicate reads最好是结合paired-end信息一起看，因为左端可能一样，但右端可能不一样，这样的reads我们不认为是duplicated reads，因为这些reads所对应的fragments是不一样的；

• DNA fragments打断一般是用超声打断，因为打断位置是随机的，一模一样的reads因此会被认为是被过分扩增产生的冗余信息。

造成duplicated reads的原因

• PCR bias，由于某个序列被错误的过分扩增，导致duplicated reads变多

• input DNA的量没有符合建库要求，特别是capture sequencing，你的测序深度越深，所需要的DNA量越多，如果不达标，更多的PCR循环数会将部分DNA反复扩增，导致duplicated reads，冻存样本质量好于FFPE样本

• 取决于打断方式，超声打断的duplicatedreads应该去掉，酶切有一定偏好性，应综合考虑。

• 其他原因，包括不同基因组相同的序列打断会增加序列相同的可能，paired-end会避免这部分内容，chr1和chr2相同的序列。

回帖后的质量控制

回帖率、覆盖度、测序深度。其中回帖率mappability

• 一般bwa回帖率在95-99%以上，而bowtie的回帖率相对低一些，主要是criteria差异，因此bowtie更严格一些，主要用于ChIP-seqmapping，bwa主要用于基因组序列比对。

造成回帖率低的原因

• 基因中混有其他物种DNA，例如PDX模型，即使mapping上也会增加突变检测的假阳性率

• 软件的参数设置是否合理，容许mismatch数目和penalty

• barcode或adaptor是否去掉，RNA序列是否用了DNA的mapping软件。