深度长文--2017年度circRNA研究进展汇总（3）

声  明

本篇目录

3

circRNA研究工具与方法进展

3.1 circRNA相关数据库

3.2 circRNA相关信息学分析工具

3.3 circRNA研究的分子细胞生物学技术进展

4

非医学相关circRNA研究进展

4.1 植物学领域circRNA进展

4.2 动物学领域circRNA进展

5

circRNA重要综述

6

circRNA研究总体趋势与未解决问题汇总分析

6.1 circRNA相关国家自然科学基金

6.2 circRNA仍未解决的问题汇总

7

参考文献

3. circRNA研究工具与方法进展 

要开展circRNA研究离不开有效的研究方法和工具，经历了多年的发展，已经积累了很多非常有效的研究工具和方法，2017年在circRNA研究工具和方法方面也取得了长足发展，包括相关的数据库工具，信息学分析工具以及生化和分子细胞生物学技术等等，下面分别详述：

3.1 circRNA相关数据库 

CSCD：肿瘤特异性circRNA数据库

9月28日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了武汉大学何春江教授和UT health Science Center韩冷教授为共同通讯作者的文章，介绍发布一个全新的肿瘤特异性circRNA数据库：CSCD（cancer-specific circRNA database[41]，网址：http://gb./CSCD）。

CSCD数据库从ENCODE中收集了19种肿瘤类型的87种细胞系及141种正常细胞的circRNA数据，构建了该数据库。总共汇总得到了272152种肿瘤特异性的circRNAs，950962种正常细胞特异的circRNAs，还有170909种为肿瘤和正常样本共有的。共收集了1394023种circRNA分子，其中外显子来源759039种，内含子来源436668种，基因间序列来源122806种。来自mRNA的1153542种，来lncRNA的42165种。预测到了MRE 76439955个，RNA结合蛋白结合位点103927037个，ORF 3462097个[41]。

图41 CSCD数据库概览（来自[41]）

exoRBase：外泌体长链RNA数据库

10月9日，Nucleic Acids Research杂志（IF 2016= 10.16）在线发表了复旦大学医学院上海肿瘤研究所黄胜林教授为通讯作者的文章，公布他们开发的专门收录外泌体中各种长链RNA（mRNA, lncRNA及circRNA）的数据库：exoRBase[42]。数据库连接：http://www.exoRBase.org

exoRBase数据库共收录了58330种circRNAs，15501种lncRNAs，18333种mRNAs，它们来自92份血清外泌体RNA-seq测序样本。作者还依据GTEx project获得组织特异性RNA表达特征，分析了相关RNA分子的组织来源。数据库收录的样本包括健康对照者32例，冠状动脉心脏疾病（CHD）6例，结肠癌（CRC）12例，肝细胞癌（HCC）21例，胰腺腺癌（PAAD）14例，乳腺癌2例[42]。

图42 exoRBase数据库概览（来自[42]）

circlncRNAnet：整合lncRNA和circRNA的功能网络的在线分析数据库

11月29日，Gigascience杂志在线发表了台湾长庚大学医学院Bertrand Chin-Ming Tan为通讯作者的文章，介绍一种整合的circRNA分析数据库：circlncRNAnet[43]。

circlncRNAnet 在线数据库由我国台湾科学家创建的关于lncRNA和circRNA功能研究的数据库，本人试用后发现该数据库非常实用，对科研课题的数据挖掘可以起到事半功倍的作用，是近年来ncRNA领域不可多得的在线友好数据分析工具。总结起来该数据库主要有如下三大优点：用户可提交分析自己的lncRNA和circRNA芯片或测序的表达数据；整合了TCGA数据库20多个肿瘤类型数据，无需编程实现在线可视化分析；分析模块非常丰富，包括lncRNA组织表达热图、箱线图、共表达散点图、circos图，基因功能富集分析GO和KEGG图，还有RBP-RNA结合蛋白网络图，miRNA网络图等[43]。具体网站链接http://app./circlnc/

图43 CirclncRNAnet数据库设计及分析流程示意图 （来自[43]）

3.2 circRNA相关信息学分析工具 

circRNA检测工具系统评价

6月8日，PLoS Computational Biology杂志在线发表了天津大学计算机科学与技术学院邹权教授为通讯作者的综述文章，汇总和比较了目前主要的circRNA分析相关技术的优势与不足[44]。

文中比较了目前已报道的常用的分析circRNA的11种工具，比较了它们在精度，灵敏度，F1 Score，AUC值（Area under Precision-Recall Curve），运行时间及物理存储空间需求等指标的情况，没有一种工具是所有指标都表现的异常出色的[44]。换言之，这11种分析方法表现为各有所长，在具体应用的时候还是需要根据需求灵活选择最合适的工具。最终作者认为CIRI、CIRCexplorer和KNIFE的各方面性能得到了最大程度的平衡是常规环形RNＡ分析工具的首选[44]。

图44 各种circRNA分析工具（来自[44]）

circRNA二级结构预测算法

2月20日，Journal of Theoretical Biology杂志在线发表了西班牙萨拉戈萨生物计算和物理复杂系统研究所Jose A. Cuesta为通讯作者的文章，介绍分析circRNA二级结构的研究工作[45]。与所对应的线性RNA不同，circRNA存在拓扑张力的问题，且不存在线性RNA那样的预测起点（circRNA的每个碱基都是等效的），因此circRNA的二级结构分析预测的方法与线性RNA有所差别，本文对circRNA二级结构预测算法做了分析。

circScan分析circRNA相互作用蛋白

3月11日， 著名预印本杂志BioRxiv在线发表了中山大学屈良鹄教授和杨建华教授为共同通讯作者的文章。介绍利用circScan分析circRNA相互作用蛋白的技术[46]。

作者开发了一种全新的分析circRNA相互作用蛋白的技术体系，称为circScan，主要是基于交联技术将互作蛋白钓取的RNA进行深度测序（CLIP-Seq），找出包含反向拼接的Reads。利用该技术流程，作者在人的样品中发现了12540种circRNA-蛋白相互作用，小鼠中发现了1090种。有趣的是，作者发现了一些circRNA与eIF3相互作用，这是一种5’-帽子不依赖的蛋白翻译起始因子，也发现了circRNA具有m6A修饰的情况[46]。这与其他文献报道的发现吻合。

图45 circScan流程分析蛋白-circRNA相互作用（来自[46]）

其他circRNA相关分析工具方法报道

 

3.3 circRNA研究的分子细胞生物学技术进展 

Cas9同源蛋白Csy4促进circRNA生成 

2月21日，RNA杂志在线发表了北卡大学教堂山分校Aravind Asokan教授为通讯作者的文章，介绍开发了一种基于CRISPR同源蛋白Csy4的促进RNA环化的技术[47]。

Csy4是CRISPR家族的一个Cas-9的同源蛋白，有时也被称为Cas6f具有核酸内切酶的功能，在将RNA分子切割后可使5’端切割后的产物更稳定。基于这一特性，作者设计了一种表达circRNA的体系，概括而言，就是在内含子中插入Csy4的识别序列，共表达Csy4后该序列下游的RNA序列被切割后降解掉，上游的序列得以稳定存在，促进了环化效率。该方法或许有助于提高circRNA表达的效率和特异性，减少线性RNA副产物。值得引入circRNA过表达体系中[47]。

图46 Csy4可以结合在RNA3’端并稳定RNA分子，促进circRNA的生成（来自[47]）

circRNA制备新技术体系

4月11日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了NIH 的Amaresh C. Panda和Kotb Abdelmohsen为共同通讯作者的文章，介绍开发了一种提高circRNA获得效率的新技术[48]。

作者报道的该技术体系在常规的RNase R消化的基础上增加了去除Poly(A)的操作，可大大提高去除线性RNA的效率，作者将该技术称为（RNase R treatment followed by Polyadenylation and poly(A)+ RNA Depletion，RPAD）。基于该技术，作者发现了大量新的内含子来源的circRNA[48]。

图47 RPAD技术流程（来自[48]）

基于tRNA的circRNA表达体系

4月13日，RNA Biology杂志在线发表了北卡罗莱纳大学教堂山分校A. Gregory Matera教授为通讯作者的综述文章，介绍一种基于tRNA剪接作用的circRNA表达策略[49]。

去年A. Gregory Matera教授就曾在酶学方法杂志发表过改技术方法的文章。本文主要分析了古生物和动物中tRNA内含子来源的circRNA，以及借助该体系开发circRNA表达系统[49]。

图48 两种不同的体内circRNA表达系统（来自[49]）

诱导表达circRNA体系

8月2日，方法学杂志Methods in Molecular Biology发表了宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Deirdre C. Tatomer、Dongming Liang和Jeremy E. Wilusz撰写的方法学文章，介绍一种可诱导表达的circRNA体系[50]。大致设计思路是将要表达的circRNA序列克隆至包含反向互补序列的表达载体中，两侧为内含子序列。该RNA分子是诱导表达的，在加入诱导剂后可自动转录产生线性RNA初产物，后由两侧的反向互补序列介导环化作用。

定量蛋白组学分析肝细胞癌中CDR1as的作用网络

9月11日，Journal of Proteome Research杂志（IF 2016=4.268）在线发表了中科院武汉水生生物所葛峰教授为通讯作者的文章，介绍在HCC细胞系中过表达CDR1as后定量蛋白质组学分析[51]。

作者在HepG2细胞中过表达CDR1as，然后进行定量蛋白质组学分析，共测到330种差异表达蛋白（DEPs），通路分析表明大部分与细胞增殖和周期调控有关。也佐证了CDR1as对miR-7的调控作用，例如EGFR是miR-7的下游分子，过表达CDR1as后EGFR出现上调。本文首次利用定量蛋白质组学分析过表达circRNA后细胞变化情况，值得借鉴。

图49 定量蛋白质组学分析CDR1as过表达后蛋白变化 （来自[51]）

circRNA-蛋白相互作用研究进展

9月26日，Theranostics杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的综述文章，系统汇总了截至目前circRNA与蛋白相互作用的研究进展[52]。文中作者系统分析回顾了circRNA-蛋白相互作用的研究进展，主要研究技术及这种相互作用的生理意义。circRNA-蛋白相互作用会对彼此都产生一定的影响，circRNA的存在可以调控蛋白的定位等状态，蛋白与circRNA的结合也会影响circRNA的生成等过程。这初步说明circRNA-蛋白相互作用是非常重要的细胞调控机制，目前的研究还处于早期，非常值得深入探索。

基于数字PCR进行circRNA的绝对定量分析

2017年共有两篇文章报道基于微滴式数字PCR进行circRNA绝对定量的分析研究。其中一篇是宁波大学医学院郭俊明教授于11月2日在线发表于Journal of Molecular Medicine杂志的文章，介绍基于微滴式数字PCR分析胃癌血浆中circRNA的测定[53]。

微滴式数字PCR（ddPCR）是最近兴起的可绝对定量的PCR技术，本文作者首次将微滴式数字PCR应用于circRNA的绝对定量。作者利用ddPCR分析了胃癌患者血液中circRNA的变化情况，通过与疾病特征的相关性分析，最终表明Hsa_circ_0001017和 hsa_circ_0061276可以作为胃癌有效的诊断标志物[53]。

图50 ddPCR检测circRNA （来自[53]）

另一篇是第二军医大学附属长海医院Qing Jing于11月7日在线发表于Biotechnology & Biotechnological Equipmen杂志的文章[54]。

circRNA在单细胞间表达的异质性

10月31日，Scientific Reports在线发表了华中科技大学宁康为通讯作者的文章，介绍基于单细胞测序，分析了细胞之间circRNA的异质性表达特征[55]。作者利用单细胞测序的方法分析了HEK293不同细胞之间circRNA的表达差异情况，结果表明细胞之间circRNA的表达存在一定程度的异质性。

uvCLAP用于circRNA蛋白相互作用分析

7月1日，预印本杂志BioRxiv在线发表了德国弗莱堡弗赖堡大学计算机科学系生物信息学组Rolf Backofen和马普学会免疫生物学和表观遗传学研究所Asifa Akhtar为共同通讯作者的文章，介绍基于uvCLAP分析蛋白与RNA相互作用的技术，其中包括了circRNA的分析[56]。

 

4. 非医学相关circRNA研究进展 

除了医学方向，2017年在非医学方向circRNA的报道也出现一定程度增长态势，主要分为植物学和动物学两个领域。

4.1 植物学领域circRNA进展 

拟南芥中发现circRNA调控RNA剪接作用

4月18日，Nature Plants杂志在线发表了法国格勒诺布尔-阿尔卑斯大学Simon J. Conn教授为通讯作者的文章，介绍在拟南芥中发现SEPALLATA3（SEP3）基因来源的circRNA形成R-loop调控同源mRNA的剪接过程[57]。

本中作者探索了拟南芥中发现SEPALLATA3（SEP3）基因第六外显子形成的circRNA对所对应的同源mRNA剪接作用的影响，该circRNA能够稳定结合所对应的DNA序列，形成RNA:DNA杂交体，导致转录暂停，募集RNA拼接因子，形成可变剪切[57]。

图51 SEP3基因第六外显子形成的circRNA调控RNA拼接过程（来自[57]）

植物类病毒突变率分析

9月14日，PLoS Pathogens杂志在线发表了西班牙瓦伦西亚大学Rafael SanjuaÂn为通讯作者的文章，介绍基于高保真深度测序分析叶绿体与核中类病毒的自发突变率[58]。类病毒基因组为单链环形RNA分子，本文作者挑选了两种类病毒进行分析，一种是定位于叶绿体的简写为ELVd的类病毒，另一个是定位于细胞核的简写为PSTVd的类病毒。结果表明ELVd的突变率高于PSTVd。

其他植物学相关circRNA研究报道

4.2 动物学领域circRNA进展

小鼠中风模型中circRNA表达特征分析

7月12日，Stroke杂志在线发表了威斯康星大学麦迪逊分校Raghu Vemuganti教授为通讯作者的文章，介绍在小鼠缺氧中风模型中伴随时间变化，circRNA表达特征的研究工作[59]。

作者在基于大脑中动脉栓塞构建的小鼠中风模型中分析了6，12和24小时后半暗带皮质中circRNA的表达特征。实验基于芯片法分析，共获得了1320多种circRNA，其中1064种来源于外显子。283种在至少一个时间点表现出差异表达，16种在三个时间点都有同样趋势的变化[59]。本文是首次探索中风模型中circRNA的变化情况，从实验结果来看，circRNA的表达明显受到生理或病理刺激因素的影响。但美中不足的是，本文是基于芯片法分析的，并未针对各种circRNA所对应的线性RNA产物和转录本的表达变化进行分析，如果能找出伴随中风症状而特异性改变的circRNA或许更有意思。

图52 小鼠中风模型中circRNA差异表达分析（来自[59]）

牛成肌细胞分化相关circRNA研究

10月26日，Cell Death & Disease杂志在线发表了西北农林科技大学陈宏教授为通讯作者的文章，介绍发现circLMO7参与调控牛的成肌细胞分化作用[60]。

作者挑选了胎牛和成年牛的肌肉组织进行RNA-Seq分析，共得到了12981种circRNA分子，其中还有530种为携带内含子的circRNA（ciRNA）。作者也针对所得到的circRNA分子进行了基因组定位，分子大小，包含的外显子情况等参数进行了汇总比较。相对于胎牛肌肉组织，circLMO7是下调最明显的circRNA分子之一。作者针对该分子做了一系列的生信分析和相关实验分析。

图53 牛成肌分化中circRNA变化情况 （来自[60]）

其他动物学相关circRNA报道

5. circRNA重要综述 

随着circRNA研究的不断深入，circRNA相关的综述文章也呈现递增趋势，2017年也有多篇重量级的综述文章发表，包括Nature Review Neuroscience杂志等等。

Nature Review Neuroscience：非编码RNA在神经退行性疾病中的作用

8月7日，Nature Review Neuroscience杂志在线发表了比利时VIB脑病研究中心Evgenia Salta和Bart De Strooper共同撰写的综述文章，系统汇总了神经退行性疾病中非编码RNA的作用研究进展。其中有较大的篇幅论述了circRNA在神经退行性疾病中的研究情况[61]。主要包括CDR1as竞争性结合miR-7与神经系统的关系，circ-ANRIL在AD疾病表观遗传方面的作用等。

Nature Immunology：LncRNA与免疫信号通路的关系

8月21日，Nature子刊 Nature Immunology在线发表了斯坦福大学医学院Howard Y Chang教授为通讯作者的文章，系统汇总了lncRNA与免疫信号的关系研究进展，其中较大的篇幅涉及到了circRNA[62]。其中包括circRNA竞争性结合miRNA的作用机制，circRNA参与调控基因转录等作用机制与免疫信号的关系，还特别提到了Howard Y Chang教授今年6月15日在Molecular Cell杂志发表过的外源表达circRNA促进细胞免疫信号激活的文章[63]。

Theranostics：circRNA与肿瘤关系

7月22日，Theranostics在线发表了昆明医科大学附属第三医院杨祚璋和谢琳为共同通讯作者的综述文章，汇总了circRNA与肿瘤的关系研究进展[64]。文中较系统的汇总了circRNA形成机制，在不同肿瘤中的研究进展以及作为肿瘤标志物的研究进展。

肿瘤中可变剪切综述

9月14日，Seminars in Cell & Developmental Biology杂志（IF 2016=6.614）在线发表了中科院计算生物学研究所王泽峰教授与Song Xiaowei为共同通讯作者的综述文章，汇总介绍了肿瘤中可变剪切与肿瘤机制的关系及在肿瘤治疗中可能的价值[65]。

Oncogene发表重要circRNA综述

10月9日，Oncogene杂志（IF 2016= 7.519）在线发表了丹麦奥胡斯大学Lasse Sommer Kristensen 教授为通讯作者的综述文章，著名RNA研究专家Jørgen Kjems教授也是本文的共同作者之一[66]。

 

本文中作者系统汇总了目前关于circRNA研究的主要进展，重点汇总了circRNA作为肿瘤标志物的进展，还针对circRNA的功能研究，将可能具有抑癌基因特征和癌基因特征的circRNA分子进行了简单的分类。关于今后circRNA研究需要解决的问题，文章给出了非常中肯的建议，其中包括circRNA的标准化命名问题，肿瘤特异性circRNA表达特征形成的机制，circRNA的修饰等问题。提高RNA-seq的样品制备质量和分析精度也是需要继续改进的方向。

图54 可作为肿瘤标志物的circRNA分子 （来自[66]）

自噬相关非编码RNA综述

4月25日，知名杂志Autophagy在线发表了哈尔滨医科大学肿瘤医院Xu Shouping和Pang Da为共同通讯作者的综述文章，系统汇总了自噬过程中非编码RNA的作用[67]。

本中系统汇总了与自噬过程有关的非编码RNA研究进展，包括lncRNA，miRNA以及circRNA。在此基础上基于信息学的通路分析和进化分析，形成了与自噬有关的非编码RNA作用网络[67]。

图55 不同物种自噬相关miRNA等非编码RNA作用网络（来自[67]）

其他circRNA相关综述列表

 

6. circRNA研究总体趋势与未解决的问题汇总分析 

6.1 circRNA相关国家自然科学基金 

circRNA研究领域在2017年获批项目情况有了巨大的飞跃，经严格统计汇总，2017年国家自然科学金获批的项目中circRNA研究相关的项目总数高达176项，其中包括了两项杰出青年基金，一项优秀青年基金，两项重点项目，94项面上项目，62项青年基金项目，15项地区科学基金项目。

从2017年获批的circRNA项目可以总结出目前circRNA研究的总体特征：

（1）肿瘤学和循环系统方向是目前circRNA研究最好活跃的学科方向。

（2）circRNA研究已实现从转录组学筛选向特定功能性circRNA机制研究的转变。

（3）circRNA与microRNA相互作用关系是目前最常见的circRNA功能研究思路，未来其他circRNA功能模型的探索会越来越受到重视。

（4）circRNA如何发挥生物学功能的基础研究仍面临不小的挑战，探索开发有效的分析RNA与其它分子相互作用研究工具是打破circRNA功能研究瓶颈的关键。

 

6.2 circRNA仍未解决的问题汇总 

刚刚结束的2017年是不平凡的一年，circRNA在这一年里取得了非常大的进展，一些科学假设被逐渐证实，包括circRNA可直接翻译多肽，circRNA存在m6A修饰等等。但科学问题具有迭代的特征，旧问题解决之后一定会伴随产生新的问题，总结而言，circRNA依然面临如下基本问题：

（1）circRNA与所在基因的互作机制是怎样的？转录水平，转录后水平等不同层次的相互关系是怎样的？

（2）除了m6A，其他修饰类型是否也可存在于circRNA中？这些修饰的生理病理机制是怎样的？

（3）circRNA的二级结构与功能的关系是怎样的？

（4）circRNA的翻译效率往往低于liner RNA，这是自然选择的结果？还是仍在进化的机制？为什么ciRS-7，SRY等基因会选择主要以环形RNA的形式存在？

（5）竞争性结合miRNA是最容易入手的机制研究模型，但如何更严谨的证明circRNA与miRNA的相互作用还需要进一步完善。

（6）circRNA进入外泌体可能存在在选择性，机制和生理病理意义是什么？

（7）circRNA亚细胞定位的机制是怎样的？

（8）组织/疾病特异性circRNA表达特征是如何形成的？会有多少种机制调控circRNA的形成？

（9）能否实现circRNA的超高分辨率光学成像，活细胞成像或动物体内成像？以更接近生理状态的条件下分析其分布和功能。

（10）人群基因组中经常出现SNP多态性或高度相关的基因区，这些位点或区域与circRNA的关系是怎样的？是否通过circRNA相关的机制发挥作用？

 

参考文献

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