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张培玉1,2 ，任 静1,2，职文倩1,2，刘澄铭1,2，郜 娜1 1郑州大学临床药理研究所，河南 450052，郑州；2郑州大学临床医学系，河南 450052，郑州 河南省高等学校重点科研项目（15A310025）；郑州大学全国大学生创新创业训练计划资助项目（2014xjxm340） 张培玉，女，本科生，研究方向：临床医学研究。 郜娜，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：药动学研究。 摘要 目的：观察和厚朴酚等五种中药有效成分对人及大鼠肝微粒体四种药物代谢酶活性的影响，为临床中西药联用进一步的研究提供依据。方法：采用人、大鼠肝微粒体体外孵育方法，以紫杉醇、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、香豆素分别作为CYP2C8、CYP2C9/CYP2C11、CYP2E1和CYP2A6/CYP2A1/2的探针药物，应用液相色谱仪检测探针药物代谢产物生成量，由此计算抑制率和IC50，分析五种中药有效成分对CYP酶的活性是否具有影响。 结果：和厚朴酚、厚朴酚对人肝CYP2C9 的IC50分别为7.7 μmol/L和7.6 μmol/L，对大鼠肝CYP2C6的IC50分别为13.0 μmol/L和3.8 μmol/L。和厚朴酚、厚朴酚对人肝CYP2C8 的IC50分别为19.2 μmol/L和84.5 μmol/L，对大鼠肝CYP2C8、CYP2E1和CYP2A1/2以及人肝CYP2E1和CYP2A6的IC50均大于100 μmol/L。栀子苷、绿原酸、黄芪甲苷对人及大鼠四种CYP酶的IC50均大于100 μmol/L。 结论：和厚朴酚对人肝CYP2C9、CYP2C8和大鼠肝CYP2C11具有明显抑制作用，厚朴酚对人和大鼠肝CYP2C9/CYP2C11具有明显抑制作用，对人CYP2C8有较弱抑制作用。 关键词 中药有效成分；细胞色素P450；肝微粒体；抑制 厚朴、栀子、金银花与黄芪是我国重要传统中药材，不仅在中成药中经常合用（常用的制剂有半夏厚朴汤、清开灵注射液、茵栀黄注射液等百种），且在临床中应用广并多与其它西药合用。 细胞色素P450酶（CYP450）是体内参与药物代谢的重要酶系[1]。其中，CYP2C8、CYP2C9、CYP2E1和CYP2A6约占肝脏CYP450酶总量的40%，据统计，目前上市的药物中由CYP2C9、CYP2E1和CYP2A6代谢的约有20%[2-3]，由CYP2C8代谢的至少有5%[4]，包括紫杉醇、阿莫地喹等。CYP450酶活性在受到诱导或抑制后将对药物的作用产生影响[5]。 研究中药有效成分与CYP450的相互作用将对临床安全用药有重要意义。一方面，西药在研发阶段均会考察其对CYP450的诱导与抑制作用，确保临床安全用药[6]，而中药在此方面的研究甚少。另一方面，中药种类多，在临床中与其他药品联合应用普遍，其活性成分对CYP450酶的影响将对药物作用产生重要影响。 本实验选用由厚朴、栀子、金银花、黄芪所提取的五种中药有效成分——和厚朴酚、厚朴酚、栀子苷、绿原酸与黄芪甲苷，采用体外探针药物法，在人和大鼠肝微粒体中分别研究其对CYP2C8、CYP2C9/CYP2C11、CYP2E1和CYP2A6/CYP2A1/2的作用（鉴于此前关于CYP3A4、CYP2D6、CYP1A2的相关研究甚多，因此此次仅针对上述四种CYP酶）。 1.1 实验动物 健康成年清洁级SD大鼠，♂，体重（200±20）g，动物合格证号：No.41003100001296，由河南省实验动物中心提供。健康人肝组织来自于郑州大学第一附属医院和河南省人民医院，切除后马上用预冷的生理盐水冲洗，并剪成小块分装于液氮保存。本试验方案已通过郑州大学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。 1.2 药品与试剂 香豆素（纯度98%，批号100205-200701）、甲苯磺丁脲（纯度98%，批号100500-200801）、氯唑沙宗（纯度98%，批号100364-201302）、紫杉醇（纯度98%，批号100382-201102） 均购自中国药品生物制品检定所；和厚朴酚（纯度98%，批号20140315）、厚朴酚（纯度98%，批号20140318）、栀子苷（纯度98%，批号20140208）、绿原酸（纯度98%，批号20140310）和黄芪甲苷（纯度98%，批号20140121）均购自郑州华文化工有限公司；Tris购自Sigma公司（分析纯）；EDTA购自湖南湘中地质实验研究所；NADPH（批号NO524F0122）购自北京索来宝科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，购自天津四友精细化学品有限公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.3 仪器 超低温冰箱MDF-U4086S（日本三洋科技设备公司）；高效液相色谱仪 Agilent 1100 型（美国安捷伦科技有限公司）；紫外检测器Agilent1100 型（美国安捷伦科技有限公司）；分析天平BP121S型（德国Sartorious）；低温高速离心机Biofuge Stratos 型（德国heraeus 公司）；电热恒温水箱HH.W21.420型（北京光明医疗仪器厂）。 1.4 方法 1.4.1 肝微粒体的制备 实验前将所用试剂、用具置于4 ℃冰箱预冷。取健康雄性SD大鼠，禁食不禁水12 h，断头处死后即取肝脏，采用钙沉淀法制备大鼠肝微粒体，差速离心法制备人肝微粒体，分装后置于-80 ℃冰箱保存。Bradford法测定蛋白含量[7]。 1.4.2 孵育反应 孵育反应分实验组和空白组，每组平行做两份。实验组中加入中药有效成分（终浓度3.91 ~500.00 μmol/L）、磷酸盐缓冲液（终浓度100 mmol/L, pH7.4）、EDTA（终浓度0.1 mmol/L）、MgCl2（终浓度5 mmol/L）、微粒体蛋白（终浓度0.5 g/L，CYP2C8组的蛋白浓度为1 g/L）和各个CYP450酶相应的探针药物。空白组除不加入中药有效成分外均与实验组相同。所用探针药分别为紫杉醇(15 μmol/L)、甲苯磺丁脲（250 μmol/L）、氯唑沙宗（100 μmol/L）、香豆素（2.5 μmol/L）。反应在37 ℃水浴中进行，预孵育5 min后，加NADPH（终浓度1 mmol/L）启动反应，按“1.4.3样品处理”项下操作。 1.4.3 样品处理 (1)CYP2C8与CYP2E1：人和大鼠肝微粒体于37 ℃水浴孵育一定时间（CYP2C8组为2 h, CYP2E1组为30 min），冰浴终止反应，加入乙酸乙酯1 mL，涡旋3 min，4500 r/min，4 ℃离心10 min，取上清，用氮气吹干后，加入100 μL流动相（甲醇:水（CYP2C8：7 : 3; CYP2E1：62 : 38））复溶，进样。 (2)CYP2A6/CYP2A1/2与CYP2C9/CYP2C6：人和大鼠肝微粒体于37 ℃水浴孵育60 min，冰浴终止反应，加入高氯酸10 μL，涡旋3 min，12000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清，进样。 1.4.4 代谢产物与酶活性测定 应用液相色谱仪检测各探针代谢产物的生成量，其色谱条件见Tab.1。四种CYP酶探针药物代谢产物的专属性、精密度及回收率等已做过方法学考察，均符合生物样本的测定要求[8-10]。 CYP酶活性的抑制程度用抑制率（inhibition ratio, IR）表示，抑制率的计算如下：IR（%）=（a0-a）/a0×100%（其中a0为空白组探针药物代谢产物测定值的平均值，a为实验组探针药物代谢产物测定值的平均值）。抑制率越高，该中药有效成分对CYP450酶活性的抑制作用越强[11]。 1.5 统计学处理 运用SPSS17.0统计软件对所有数据进行统计学分析，所有数据均用均数±标准差（x± s）表示。两组间的比较采用配对样本t检验，检验水准α为0.05。 2.1 标准曲线 以7-羟基香豆素、4-羟基甲苯磺丁脲、6-羟基氯唑沙宗和6α-羟基紫杉醇浓度对样品峰面积A作线性回归，所得标准曲线方程见Tab.2，线性良好，符合生物样本的测定要求。 2.2 抑制率与半数抑制浓度IC50 通过实验我们发现和厚朴酚、厚朴酚、栀子苷、绿原酸和黄芪甲苷在浓度为125μmol/L时对四种酶的抑制率差异较大。其中，和厚朴酚与厚朴酚对大鼠肝CYP2C8、CYP2E1、CYP2A1/2和人肝CYP2E1、CYP2A6以及栀子苷、绿原酸、黄芪甲苷对人、大鼠四种CYP酶的抑制率均未超过50%。故其IC50均大于100 μmol/L。 在125μmol/L浓度下，和厚朴酚、厚朴酚对人CYP2C8、CYP2C9以及大鼠CYP2C11的抑制率超过85%，在3.91~500.00μmol/L浓度范围内对人和大鼠肝微粒体CYP2C9/CYP2C11与CYP2C8的抑制率见Fig.1。根据SPSS17.0统计软件回归分析进一步得到和厚朴酚、厚朴酚在上述浓度范围内对人肝CYP2C9的IC50分别为7.7 μmol/L和7.6μmol/L，对人肝CYP2C8 的IC50分别为19.2 μmol/L和84.5 μmol/L，对大鼠肝CYP2C11的IC50分别为13.0 μmol/L和3.8 μmol/L。 目前，有关中药与CYP450酶相互作用的研究越来越多，青蒿素的发现更是肯定了中医药的重要性。现今，选择适当探针药物评价CYP450酶活性的方法已被广泛使用，通过一些恰当的指标评价肝脏CYP450酶的药物代谢能力，可以为临床合理用药提供依据。 根据通用的CYP450酶抑制剂强度分级规则[12]：IC50<1μmol><>50<10μmol>50>10μmol/L为弱抑制剂，IC50>100μmol/L时认为没有抑制作用。本实验研究结果显示：和厚朴酚与厚朴酚是人CYP2C9的中等强度抑制剂。据报道，CYP2C9参与约10%临床常用药物代谢，例如甲苯磺丁脲、苯妥因、格列本脲、络沙坦和许多非甾体类抗炎药[13]，厚朴酚可能影响由该酶参与代谢的上述药物的药动学特性，对于其在体内是否亦有上述作用仍需进一步考察。 此外，我们对比高雯等人[14]的研究结果发现厚朴提取物对CYP2C9的IC50为0.470mg/L(相当于1.76μmol/L)，提示厚朴提取物为CYP2C9的中等抑制剂。本文与其研究结论大致相符，但所求IC50有一些偏差，原因可能是人和大鼠肝微粒体存在差异以及所选抑制剂成分不同。本实验与之最大区别在于分别研究了厚朴酚与和厚朴酚对CYP酶的抑制作用及抑制强度。同时，本实验也发现栀子苷、绿原酸、黄芪甲苷对人和大鼠4种CYP450酶、厚朴酚与和厚朴酚对大鼠CYP2C8均无抑制作用，所以这些成分在与经CYP450酶代谢的药物合用时产生相互作用的风险较低。 FDA建议，在进行体内相应CYP450酶的代谢相互作用研究前，要先进行 CYP450酶相关的体外实验，得到Cmax/Ki（Cmax为系统循环中药物最大浓度，Ki为抑制常数），Cmax/Ki<0.1时，不易发生体内药物相互作用；当cmax i="">1时，发生风险较高[15]。袁成等[16]的结果显示，在大鼠灌胃给予厚朴提取液后，厚朴酚与和厚朴酚的Cmax分别为0.974 mg/L和0.522 mg/L (相当于3.66μmol/L和1.96μmol/L)。则厚朴酚与和厚朴酚Cmax/Ki分别为0.04~0.96和0.1~0.15。因此，有必要进一步考察厚朴酚与和厚朴酚体内对大鼠CYP2C8和CYP2C9的影响。 参考文献：略 |
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