|
叶海主1，陈亚娟2，赵文英1，刘晓平2 1皖南医学院第一附属医院弋矶山医院，肿瘤内科，芜湖 241001，安徽；2皖南医学院药学院，芜湖 241001，安徽 国家自然科学基金（81272485） 叶海主，男，硕士研究生，研究方向：肿瘤内科。 刘晓平，通信作者，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤分子药理学。 摘 要 目的：检测FoxO3/Keap1/Nrf2信号通路在肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞中的表达差异，探讨FoxO3/Keap1/Nrf2信号在肿瘤细胞耐药中的作用。方法：构建肺癌A549耐药（A549/DDP）和结肠癌HCT-8耐药（HCT-8/5-FU）两种细胞株，耐药细胞对药物的敏感性用MTT法检测；分别用qRT-PCR、Western blot检测FoxO3/Keap1/Nrf2信号通路成员在非耐药和耐药肿瘤细胞中mRNA和蛋白的表达情况并进行比较。结果：A549/DDP的耐药性明显高于A549细胞（P<0.05)，耐药倍数为5.25倍；hct-8>P<0.05），耐药倍数为31.67倍；两种耐药细胞a549>结论：FoxO3/Keap1/Nrf2信号通路与肿瘤耐药性有一定相关性，为深入研究该通路并探索降低肿瘤耐药性的治疗策略提供参考。 关键词 FoxO3/Keap1/Nrf2信号通路；A549；HCT-8；耐药 化学治疗是临床上治疗恶性肿瘤的主要手段之一，但肿瘤对化疗药物耐药是导致临床化疗失败的重要原因，据报道，超过50%的肿瘤在治疗过程中迅速产生耐药，只有小部分肿瘤对化疗敏感[1]，肿瘤耐药严重影响了患者的治疗效果和预后。肿瘤耐药机制复杂多样，目前尚未被完全阐述，主要机制有药物外排的增加、药物代谢的改变、DNA修复和细胞周期的改变、细胞凋亡和自噬的变化、诱导上皮-间质转化（EMT）、肿瘤干细胞的生成以及与耐药相关的一些信号通路[2]。近来有报道称肿瘤细胞的耐药可能与Keap1/Nrf2/ARE信号通路相关[3-4]。一般情况下，核转录因子Nrf2集中于细胞浆内，在Keap1的作用下Nrf2在胞浆中进行泛素化和蛋白酶体降解，从而保持Nrf2低活性生理状态。当细胞毒性药物（或其它亲电子试剂）刺激细胞时，Nrf2会摆脱Keap1介导的降解作用，转至细胞核内，与肌肉-腱膜纤维肉瘤（MAF）蛋白组成异二聚体，并且与抗氧化反应原件（ARE）序列结合促使下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表达，降解外源性药物而使其毒性降低，增加抗肿瘤药物可溶性加快其排出，减弱药物对肿瘤细胞杀伤力和细胞毒性，诱导耐药的产生[5]。因此抑制Nrf2进入细胞核内，就可以减少对化疗药的解毒，增强肿瘤对药物的敏感性。 叉头转录因子(forkhead box, FOX)家族成员FoxO3在肿瘤发生发展和耐药中也起到关键性作用，FoxO3是经典信号通路PI3K/Akt的重要作用底物，而且研究发现，抑制FoxO3可以导致Keap1的下调和Nrf2信号的活化，通过抑制FoxO3/Keap1/Nrf2信号通路途径提高人类胆管癌的发生和增强其抗药性[6]，Nqo1是醌氧化还原酶，为Nrf2/ARE下游调节序列表达蛋白。本研究主要通过检测结肠癌和肺癌细胞及其对应的耐药肿瘤细胞中FoxO3/Keap1/Nrf2信号通路的表达差异来进一步证实FoxO3/Keap1/Nrf2通路与肿瘤耐药的相关性，为改善肿瘤耐药提供新靶点。 1.1 主要材料和试剂 CO2培养箱(德国Kendro Heracell公司)；人肺癌细胞株A549及顺铂（DDP）耐药细胞株A549/DDP、人结肠癌细胞株HCT-8及5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药细胞株HCT-8/5-FU（由湘雅实验室提供）；顺铂水剂、5-FU、二甲基亚砜（DMSO）、二甲基噻唑（MTT）均购自Sigma公司；胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、DMEM培养基、RPMI-1640培养基、0.25%胰酶消化液均购自Gibco公司；PCR实验相关试剂，引物购于上海吉凯基因化学技术有限公司；Western blot实验相关试剂，实验一抗购自Cell signal公司，二抗购自北京鼎国生物公司。 1.2 细胞培养 肺癌细胞株A549、A549/DDP和人结肠癌细胞株HCT-8、HCT-8/5-FU分别用含10%胎牛血清的DMEM培养液和RPMI1640培养液（100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素）完全培养后，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。为保持A549/DDP的耐药性，该细胞需培养在含DDP 0.5 μg/mL的上述培养液中，于实验的前两天更换为无DDP的上述RPMI1640培养液。同样，为保持HCT-8/5-FU的耐药性，需加入15 μg/mL 5-FU于该细胞培养基中。细胞呈贴壁生长，2~3 d传代1次，选择对数生长期的细胞实验。 1.3 MTT法测定A549/DDP、HCT-8/5-FU分别对A549、HCT-8的耐药倍数 实验分为A549/DDP组、A549组、HCT-8组和HCT-8/5-FU组，每组有实验组和对照组。试验中取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，以浓度4×104 mL-1，接种到96孔培养板中(100 μL/孔)，培养12 h，在A549组中加入终浓度为0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg/mL的DDP，在A549/DDP组中加入终浓度为2.5、5、10、20、40、80和160 μg/mL的DDP，在HCT-8组中加入终浓度为3.5、5.3、8、12、18、27、40.5和91 μg/mL的5-FU，在HCT-8/5-FU组中加入终浓度为10、20、40、80、160、320、640、1280和2560 μg/mL的5-FU。每组浓度设4个复孔。在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续放入培养箱4 h，吸净上清液，每孔加入DMSO 150 μL，于摇床振荡10 min左右，在492 nm处测定每孔吸光度OD492值。然后直线回归法得出DDP和5-FU的半数抑制浓度IC50值，耐药倍数=耐药株IC50值/敏感株IC50值，算出耐药倍数。细胞存活率=(A实验组-A空白对照组)/(A实验对照组-A空白对照组)×100%。 1.4 qRT-PCR实验 收集生长状态良好的细胞，去废旧的培养基，向细胞培养瓶中加入1 mL Trizol，充分混合均匀后室温条件下静置5 min。用细胞刮将裂解后的细胞刮向一边，移液枪将样品转移至新的1.5 mL EP管中，置于冰上。加入0.2 mL氯仿，颠倒混匀15下，冰上静置5 min后，4℃离心，12 000 rmp，15 min，以分离RNA离心后所得上层液吸至新的EP管中，加入等体积异丙醇（事先放于-20℃冰箱中预冷），颠倒混匀15下，放置于-20℃环境中助沉30~60 min。取出EP管，4℃离心，12 000 rmp，15 min。离心后所得上层液去掉，向沉淀部分加入1 mL现配的预冷的75%乙醇，4℃离心，7 500 rmp，5 min，再弃上清，把含有沉淀部分的EP管放置超净工作台开风机干燥30 min，待RNA变透明即可。干燥后每管加入20 μL DEPC水使RNA溶解。再取已备好的EP管若干，标记好。在EP管中依次加入DEPC水1 μL Oligo（dT），1 μL已经抽提的RNA，2 μL dNTP混合物，短暂离心后，使之充分混匀，以上操作在冰上进行。65℃温浴5分钟后，立即置于冰上1 min，短暂离心混匀置于冰上依次加入4 μL 10×RT缓冲液，1 μL RNAse Inhibitor，1 μL MMLV逆转录酶，再次短暂离心充分混匀，37℃水浴1 h进行逆转录，70℃温浴10 min使RT酶失活，得到cDNA。再取已备好的EP管若干，做好标记。依次在管中加入：模板cDNAPCR缓冲液，灭菌蒸馏水，Taq酶，Akt、Keap1、FoxO3、Nrf2、Nqo1上游引物和下游引物；均匀快速稍离心一次；反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性、58℃退火、72℃延伸各30 s，共30个循环；72℃终延伸7 min；PCR产物-20℃保存。 1.5 Western blot分析 于冰上裂解A549细胞、A549/DDP细胞、HCT-8细胞、HCT-8/5-FU细胞提取全蛋白。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定546 nm的波长，然后由标准曲线分别算出各细胞细胞核和细胞浆的蛋白浓度。取适量蛋白样品至新1.5 mL离心管中，加蛋白上洋缓冲液，混匀，100℃煮10 min，12 000 rpm室温离心5 min，将上清液转至新的离心管中，即电泳样品。将样品加到SDS-PAGE凝胶加样孔内，先稳压80V 30 min，再调120V 60 min，湿转至PVDF膜上，用TBST洗涤液漂洗PVDF膜15 min×3后，将膜转入封闭液中封闭3 h，加一抗稀释液，其中Keap1、FoxO3、p-Akt（Ser 473）、Nrf2、Nqo1为目标检测蛋白，Actin为内参照。一抗加完后，4℃摇床孵育6 h或者过夜，加入二抗稀释液，孵育2 h，加显色试剂，利用凝胶成像系统扫描分析，根据需要输出图形或者数据。分析实验结果，比较耐药细胞和非耐药细胞各蛋白表达情况。 1.6 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行相关统计学分析，用均数±标准差（x± s）表示。各组间比较采用t检验。检验水准α=0.05，P<> 2.1 肿瘤耐药验证 2.1.1 A549及A549/DDP对顺铂的IC50值及耐药倍数 A549和A549/DDP细胞均随着顺铂浓度的升高，细胞生存率逐渐下降。顺铂对A549细胞的半数抑制浓度IC50=16.80 μg/mL,对A549/DDP细胞的半数抑制浓度IC50=88.1809 μg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)，耐药倍数为5.25倍，可以认为a549> 2.1.2 HCT-8及HCT-8/5-FU对5-FU的IC50值及耐药倍数 HCT-8和HCT-8/5-FU细胞均随着5-FU浓度的升高，细胞生存率逐渐下降。利用SPSS18.0软件计算出5-FU对HCT-8细胞的半数抑制浓度IC50=33.743 09 μg/mL，对HCT-8/5-FU细胞的半数抑制浓度IC50=1 068.596 μg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)，耐药倍数为31.67倍，可以认为hct-8> 2.2 FoxO3/Keap1/Nrf2通路成员的mRNA表达 肿瘤耐药细胞株A549/DDP和HCT-8/5-FU相对于非耐药肿瘤细胞内的FoxO3、Akt的mRNA表达水平降低而Nrf2、Nqo1 mRNA表达水平较正常水平升高。见Fig.3。 2.3 FoxO3/Keap1/Nrf2通路成员的蛋白表达 Western blot结果显示，耐药细胞株A549/DDP和HCT-8/5-FU，与非耐药细胞株相比，Keap1、FoxO3的蛋白表达水平降低而p-Akt、Nrf2、Nqo1的蛋白表达水平升高。见Fig.4。 对于大多数已发生转移的肿瘤，化疗是优先的选择[7]。在肿瘤的化学预防中，Nrf2的作用已不容忽视，Keap1/Nrf2通路与肿瘤的化疗耐药密切相关。在结肠癌中，5-FU可以通过活化抗氧化信号通路Nrf2导致HT-29细胞耐药性增加[8]；胃癌中对Nrf2的异常调控，也可以引起其下游信号分子表达或者活性增强，从而导致耐药性的产生[9]；在卵巢癌的研究中，经siRNA转染，使卵巢癌SK-OV细胞中的Nrf2下调后，发现细胞对顺铂的敏感性会明显增强，并且在耐阿霉素的卵巢癌细胞中发现Nrf2呈高表达状态[10]；在乳腺癌中，Nrf2诱导剂（绿茶多酚、异硫氰酸酯萝卜硫素）可以使乳腺癌细胞对紫杉醇、多柔比星等化疗药物的敏感性明显降低[11]；Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇作用于肺癌细胞A549中，可以增强A549对顺铂的敏感性[12]。在本实验研究中，耐药肿瘤细胞A549/DDP和HCT-8/5-FU中Nrf2及其下游信号分子Nqo1相对于非耐药细胞株A549和HCT-8均明显增高，与前人实验研究结果一致。 叉头转录因子家族包括19个亚族，他们的共有结构是含有一个高度保守的结合域，称为叉头框，由大约110个氨基酸组成[13]。FoxO家族成员可以直接参与下游靶基因的调控，主要涉及细胞周期阻滞，衰老，细胞调亡，新陈代谢，分化和氧化防御[4]。其中，Fox03可以通过很多不同的信号通路来诱导目的基因，包括PI3K-Akt，IKK(inhibitor ofnuclear factor kappa-B kinase，IKK)，肾素-血管紧张素系统-细胞外调节蛋白激酶 (renin-angiotensinsystem-extracel lular regulated protein kinases，RAS-ERK)，血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serumandglucocorticoid-regulated protein kinase，SGKs)等信号通路[14-16]。也有很多研究表明，FoxO3与肿瘤耐药有关，Ausserlechner等[17]指出FoxO3a的失活使白血病细胞得以逃避TRAIL和NOXA基因的凋亡作用，导致部分急性白血病对强的松耐药；Shiota等[18]在慢性髓性白血病中发现，去甲基化药物可以通过去磷酸化作用重新激活FoxO3a，促进凋亡前基因Bim和PUMA的表达，减少耐药的SMK-1R细胞的存活，提示FoxO3具有逆转肿瘤耐药的潜在作用；也有人用siRNA转染大肠癌细胞阻断P85和PI3K调节亚基，增加FoxO活性，出现细胞增殖、周期停滞和对5-FU敏感性增高的结果[19]；miR-551b通过下调FoxO3和TRIM31可以提高卵巢癌细胞的增殖、侵袭和对药物的耐药性[20]；用siRNA转染大肠癌细胞,阻断P85和PI3K调节亚基，增加FoxO活性，出现细胞增殖、周期停滞和对5-FU敏感性增高的结果[21]。本实验中，耐药株A549/DDP和HCT-8/5-FU中FoxO3的比非耐药细胞中明显降低，研究基本相符，我们初步假设FoxO3的降低可能与A549和HCT-8的耐药性增强有关。 FoxO3和Nrf2均在细胞抗氧化应激过程中起关键作用，不久前，尤涵教授课题组的最新研究成果揭示了在胆管癌耐药中，FoxO3/Keap1/Nrf2信号通路的重要作用及其分子机制。通过之前的介绍也表明Nrf2的激活也是引起人类肿瘤耐药的核心机制，该课题组把FoxO3和Nrf2联系起来，抑制FoxO3可以过度激活Nrf2信号通路，下调肿瘤细胞中ROS水平，在给予氧化应激刺激时细胞表现出存活率增加，从而增强胆管癌细胞的耐药性[6]。该小组还发现FoxO3是Keap1的上游转录因子，使细胞内的FoxO3耗尽后，Keap1 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低，重要的是，Keap1是FoxO3灭活介导Nrf2诱发必不可少的，并且通过FoxO3调节Keap1这一转录调控只在人源细胞中存在；此研究还表明PI3K/Akt活化增强Nrf2激活，当异位myr-Akt转染CCA细胞可以观察到强大的Nrf2诱导，Keap1表达降低，用myr-Akt介导的FoxO3失活后也可以发现Keap1的下降和Nrf2的激活。并且可以在临床收集的胆管癌样本中发现FoxO3与Keap1的表达呈正相关，而与Nrf2呈负相关，这可能是由于高EZH2的表达。此研究还表明TNF-α能够通过阻断FoxO3-Keap1轴诱导Nrf2活化，此课题组还建立了裸鼠移植瘤模型来验证FoxO3/Nrf2在胆管癌耐药中的作用，结果当FoxO3被抑制后，化疗药物对移植瘤完全不敏感，而将FoxO3和Nrf2均敲低时能逆转耐药；该文中还提出FoxO3与CCA耐药性的关系可能扩展到其他来源的肿瘤，本实验研究主要以尤涵教授课题组的研究成果为基础，进行了关于FoxO3/Keap1/Nrf2信号通路在肺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT-8耐药的初步研究，结果中FoxO3、Keap1和Akt的mRNA表达水平降低而Nrf2和其下游分子Nqo1的mRNA表达水平升高，Keap1和FoxO3的蛋白表达水平降低而p-Akt、Nrf2和Nqo1的蛋白表达水平升高，虽然耐药细胞中Akt mRNA水平有轻微的升高，但是p-Akt蛋白水平有明显升高，说明耐药肿瘤细胞中Akt信号通路处于活化状态。本实验初步表明在肺癌细胞或者结肠癌细胞中，也可能存在FoxO3对Keap1/Nrf2的转录调控从而介导肿瘤细胞产生或失去耐药性，此研究下一步拟在肺癌和结肠癌细胞中沉默和高表达该通路并检测，观察其耐药性的增强和改善。肺癌和结肠癌发病率高，其耐药现象是临床上的难题，通过FoxO3/Keap1/Nrf2通路设计治疗手段，对产生耐药现象的肺癌以及肠癌病人的治疗提供帮助。 参考文献：略 |
|
|
