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谁把生命点亮（上） 《流萤和水母》 2008年8月8日晚8时北京奥运会开幕式，2008位表演者用传统的击缶动作拉开了整场鸟巢大秀。这一古老乐器表面镶嵌的电子灯光随着手臂的敲击和接触绽放出蓝宝石般优雅的光芒，这一幕给在场的所有观众留下了难忘的记忆。而就在此后不久的12月10日，斯德哥尔摩音乐厅内瑞典国王古斯塔夫将一本精美的证书亲手颁发给美籍华裔科学家钱永健（RogerTsien），这一天他和日裔学者下村修（Osamu Shimomura）、美国学者马丁·查尔菲（Martin Chalfie）一起获得了当年度的诺贝尔化学奖，带给他们三位殊荣的恰巧也是一束惊艳美丽的荧光，而这束光将照向生物学研究未知的深处。 2008年北京奥运开幕式2008名表演者以击缶方式组成图案 [Source: read01] “银烛秋光冷画屏，轻罗小扇扑流萤”，人们对于生物发光现象的观察古已有之。达尔文在《进化论》提出伊始就总结了生物发光现象，然而在当时由于理解深度的限制，他还只能把这种现象作为进化理论面临的挑战而列在困难问题表当中。在所有的发光生物中，萤火虫当然是最为人们所熟悉的代表，不过能够发光的生物并不只有这一种，事实上有成千上万的物种，尤其是微小的生物可以射出光芒。符合直观猜想的是，越是黑暗的环境越能够孕育发光生命体，比如夜间出没的流萤就是一例，但更典型的还是暗无天日的深海海底，在那里有90%以上的生物均有不同程度的发光能力。这种能力是如此的普遍和重要，以至于人们在有些物种的进化史上发现相似的发光功能竟然独立的进化过30次以上。如果说生命体是善于设计的工厂，大自然就是高效竞争的市场。当需求旺盛时，供给会喷发式的出现且所有的竞争者必将竭尽全力的细分市场以寻求各自妥适的空间。基于这样的道理，看上去类似的功能完全可能由不同的设计来实现，这就是为什么生物发光的底层物理机制会千差万别的原因，也是为什么发光性状能够反复多次被独立进化出来的原因。 蓝色灯笼鱼（ Blue Lanternfish, Tarletonbeania）标本，可以看到鱼身上的发光器官。 尽管在许多的物种中都发现了生物发光现象，但由于全部的开花植物和几乎全部的有骨架的动物都不具备发光能力，有理由推测大量的生物发光功能是各自独立进化出来的。深海鱼类在发光微生物的帮助下，更加容易实现这一过程。例如明尼苏达圣·克劳德州立大学的鱼类学家马特·戴维斯（MattDavis）利用基因技术对辐鳍鱼（Ray-finned Fish）进行分析，发现某些物种在没有细菌介入的情况下独立进化过8次发光功能，而在有细菌帮助的情形下，进化次数达到27次。 [Source: Matt Davis] 萤火虫的身体光源采用的是反应式发光机制，其中的荧光素（lufiferin）是底物质，而荧光酶（luciferase）是催化物质。在荧光酶的催化作用下，荧光素、三磷酸腺苷（ATP）与氧发生反应，ATP提供能量产生激发态的化合物。随着激发态光子的释放，萤的身体就会被点亮。这一机制最突出的优点是，化学能量几乎全都转化为光能而没有多少热量的伴生，这是最理想的冷光源，和我们日常生活中的灯光刚好相反，后者是热光源。弗罗里达大学昆虫和线虫系（Departmentof entomology and nematology）教授马克·布拉汉姆（Marc Branham）对此打趣说：萤火虫并不想要一个烤焦的屁股。 萤火虫可以灵活的控制身体上尾灯的亮灭，开光就安放在最关键的氧气输送环节。当它不想要继续亮灯时，切断氧气的供应，光亮就会停息。萤火虫没有肺不会憋气，它是靠一条细细的管道把氧气送往细胞的。这个管道可以通过肌肉控制开合，这有点类似于屏住呼吸的效果，但是肌肉的缩放速度不可能太快，这就很难用来解释萤火虫有时出现的高频闪光。其实，萤火虫最后被找到的能够控制闪光灯的秘诀和男人吃的伟哥相似，都是依靠一氧化氮。为发光器官输送的氧气流通常会和细胞的线粒体结合而无法继续供应照明所需，但是一氧化氮的出现可以优先结合线粒体，让氧气得以深入到下面的发光环节。不过一氧化氮极易分解，当它们完全消失后，氧气就会重新被线粒体阻挡而关闭萤火虫身上的光源。 以上介绍的过程只是最为常见的一类反应机制，事实上，萤火虫作为一个大的类别，其发光性状的多样性比我们想象的要复杂得多。成虫和幼虫的发光原理不一样，不同类型的萤虫种别的发光机理也不尽相同，甚至有些成虫人家根本不发光，在已经弄清楚的反应类型中参与作用的分子的分子量从21,000到420,000相差数十倍之多。这么复杂的情形导致了一个问题，就是实在很难解释清楚到底萤火虫为什么需要进化出发光功能。如果发光是必不可少的，为什么有些萤火虫舍弃了这一基因呢？如果它主要是在幼年时期发挥作用，为什么一些类型的成年萤也具有照明能力呢？如果它是为了择偶而被选择出来的，为什么仍有些萤火虫还在使用古老的信息素作为性信号的载体呢？这些困惑让一位专门研究萤火虫的日本专家神田左京最后不得不说出一句无奈的结论，“因为萤火虫身体内有发光物质，所以他就要发光。”这实在是一句正确的废话。当然，一般的研究者仍然认为，萤的幼虫辉光主要是一种身份标志。幼虫为了自保进化出了一种防御性的类固醇，这会让捕食者产生倒胃的口感。为了向杀手们更加强烈的凸显自己的这种劣质食材的身份，幼虫便用辉光加以警告，这和鲜艳的蘑菇往往有毒是类似的。至于成虫，求偶应该至少是其发光的一个重要的部分原因。每个萤火虫都有自己独特的闪光模式，就像非洲的节奏音乐鼓手一样，雌萤会根据雄萤闪光的能力来选择心仪的配偶。已经有一些实验证明，更高的闪光频率和更亮的闪光强度都会增加对异性的吸引力，就和人类社会的金币焕发出的光芒一样。 生活在日本京都附近的鸭川（Kamo river）的萤火虫发光原理。 整个发光过程分为三个步骤：第一步在二价镁离子的作用下，荧光酶催化荧光素与能量提供者ATP结合；第二步在氧分子作用下，ATP水解后断裂高能磷酸键变成AMP，释放的能量供应化合物进入激发态，同时释放二氧化碳；第三步，激发态化合物释放光子，完成发光。 [Source: reaxyschem.elsevier.com] 或许萤火虫闪光的目的只是求偶和标记，它将只是一种夜间的间歇式的发光需要，但是在深海持续的黑暗中，光亮就有理由维持长时间的存在了，而这意味着完全不同的发光机制。儒勒·凡尔纳在名著《海底两万里》中曾经提到鹦鹉螺号（Nautilus）在航行中遇到过一片闪亮的“牛奶海”，这并不是单纯的科学幻想。许多有经验的水手都知道在夜航时如果向远处静静地眺望，就有可能感受到水面远处泛起的光晕。千万不要以为这只是星光的投影，因为在乌云遮挡的阴天，这种微光也可能出现。1995年，传说中的“牛奶海”第一次被人们明白无误地观察到。美国海军研究院（NPL）的斯蒂芬·米勒（StevenMiller）领导的一个天基观察小组在一副合成的卫星图像中直接看到了索马里外海的印度洋面上有一片长约300公里、宽约90公里、面积大约相当于美国康涅狄格州的硕大水域上竟然发出了异样的光彩。这一不可思议的景象的成因尽管还有争议，但主流的观点都认为它来自于大规模海洋发光微生物体聚集时射出的光亮。海洋尤其是深邃的深海的确是最有照明需求的生存环境，地球上总共有超过700个属的动物会发光，其中80%以上都分布在海洋，但人们对于深海生物的了解却是在很晚才开始的，而最终揭开深海生物发光之谜的历程却是从一种来自浅海的水母开始的。 在美国西海岸太平洋的海水中到处都飘荡着一种漂亮的透明的水母，它叫做维多利亚多管发光水母（Aequoreavictoria），人们更愿意用一个优雅的外号来称呼它：水晶水母。这或许是因为它不仅像其他水母一样晶莹剔透，而且还因为它的伞状结构外缘处会投射出迷人的淡绿色光泽。谁也没想到，就是这种看似柔软无力的水母极大的改变了整个生物学的研究走向。 NPL小组看到的“牛奶海”（milk sea） 海洋上的生物发光并不罕见，“双尾鞭毛虫”的器官可以产生短暂而明亮的闪光，常见于船尾的水流或者波浪之中。但此次的情况不同，这里的辉光是持续不间断的，多数学者认为这有可能是发光细菌所致，因为它们可以做到连续发光。但这一解释遇到的一个困难是如果细菌可以自由移动的话，它们为什么要大规模的聚集在一起。要达到可以被卫星看到的程度，这片海域的发光细菌的密度将非常的高。或许，这里真的有一片类似牛奶一样的富含营养的基质，才能吸引众多的细菌前来。 [Source: Live Science] 玩过微软飞行模拟器（Microsoft Flight Simulator X.）的人对于一个叫做“星期五”的小海港一定不陌生，这个位于华盛顿州圣胡安岛的机场正是模拟飞行默认的起点。星期五港（FridayHarbor）的名字起源于当地的一个印第安人的姓名，这不由得让人联想起鲁滨逊漂流记里那位叫做“星期五”的奴仆。1960年夏天，在这个平静的小海港里，人们也许会注意到有一个有趣的小团队在一刻不停的忙碌着。为首的一个人和另外几位队员包括里面的小男孩、小女孩都长着东方面孔，其他的成员则是几位白人。在这整个夏天，这些人成天都扛着罩网，提着水桶，在太平洋里的海水里不停地捞着什么东西。带队的人叫做下村修，团队成员都是他的亲属或助手，而他们正在捕捞的就是太平洋中大量漂浮的只有老鼠那么大的维多利亚水母。 用命运曲折来形容下村修再合适不过，这些“曲折”中既有不幸的走向，也有幸运的偏爱。不幸，说的是他在16岁时就亲身经历了长崎核爆炸；而幸运指的则是此后一连串的巧合把他最终引向了诺贝尔之门。他幸运的没有受到太严重的核爆给生理带来的影响，虽然他曾经因为爆炸的闪光短暂失明了半分钟；他幸运的因为长崎医科大学在被核爆毁坏殆尽后不得不把药学部搬迁到下村修的住家附近而得以进入影响了他一生的专业；在本地的安永实验室从事了四年物质提纯的工作，这一项他后来回忆说并不喜欢但是却帮他打下了良好的基本功的工作后，他被安永（Yasunaga）教授推荐到名古屋大学(NagoyaUniversity)江上修(Egami)教授那里去深造。事不凑巧，乘坐火车赶去名古屋的当天江上修教授恰好不在办公室，下村修遗憾万分的没能进入当时最为热门的分子生物学领域。然而殊不知，这看似的不幸其实又是一种幸运，他在扑空了江上修之后又去顺路拜访的另一位名古屋大学教授平田义正(YoshimasaHirata)邀请下村修到他的实验室工作，而正是在这里他真正走上了自己的发光之路。 1960年夏天，下村修的捕捞水母小分队。（左三为下村修） [Source: ibric.org] 自从1887年，生物学教授拉斐尔·杜布瓦（Horace RaphaelDubois）对一种发光甲虫（Pyrophorus）的腐烂尸体在冷水热水中进行了混合发光实验之后，人们逐渐意识到可能有两种物质共同存在才引起了发光，分别是发光物质的荧光素（luciferin）和催化物质的荧光素酶（luciferase）。到了1935年，发光生物学研究先驱牛顿·哈维（EdundNewton Harvey）从水母的溶液中成功分离出一定纯度的荧光素(Cypridina），但却始终不能将其提纯到结晶水平，这个难题后来正是由下村修在1957年取得突破的。 当时下村修在平田教授的要求下也正在进行荧光素的纯化结晶工作，平田之所以这么安排，其考虑很简单，就是下村修有过多年的物质纯化训练与深厚功底最适合这个课题而这个课题本身又是当时的热门。然而提纯结晶的挑战当真困难，下村修做了好一阵子也没有任何头绪。有一天晚上，他已经决定要放弃当日制定的实验方案，因为天太晚了，在配好试剂后，下村修没有收拾清理就离开了实验室。万没想到第二天早上一来到，他惊奇的发现荧光素的结晶已经出现。就这样在阴差阳错之下，下村修取得了关键性的进展，这个过程和弗莱明发现青霉素的遭遇何其相似。 下村修发表成果的论文“海萤荧光素的结晶”（CrystallineCypridina luciferin）引起了美国普林斯顿大学弗兰克·约翰逊（Frank Harris Johnson）的重视，这位普林斯顿科班毕业的高材生正是前面提到的牛顿·哈维的弟子，当时他的小组也在独立的进行相似的课题，故此他特意邀请下村修加入自己在普林斯顿的实验室一起进行荧光素和发光水母的深度研究。这位下村修人生中的第三位导师，也是一位艺术才华横溢的导师，最终把下村修引领到了其一生当中最重要的发现时刻。顺便说一下，这里提到的约翰逊的艺术才华是指他热衷的素描，尤其是对女性肖像的素描。约翰逊一直承诺要给下村修画一幅临摹，但始终未能兑现，他总是告诉下村修自己如果作为一名艺术家可能会比作为一名科学家更成功，然而下村却总是对此偷笑。 下村修1957年11月发表的论文“海萤荧光素的结晶”（CrystallineCypridina luciferin） [Source: naosite.lb.nagasaki-u.ac.jp] 1960年，下村修在约翰逊的帮助下来到美国。经过一番短暂游历，9月17号，他来到了普林斯顿。第一天，他就在约翰逊教授的家中蹭了一晚，此后在找房子的过程中却遭到了种族歧视，因为他的东方面孔，第一位房东在开门后把门又迅速关上了。好在教授和同事都热情地欢迎他，他很快就完全融入到崭新的研究环境当中并立刻着手和太平洋的维多利亚水母打起了交道，这才有了刚才所说的暑假期间他带领亲友在“星期五港”打捞海鲜的经历。 抓到的水母成千上万，下面的工作粗看起来似乎是轻车熟路，大体就是两个步骤：分离和提纯，而目的只有一个，找出发光的要素。约翰逊教授并不擅长于提纯方面的工作，尽管他总是乐于和下村修讨论问题，但是一旦涉及到提纯的思路和做法，他总是很少发表意见以免影响到自己的学生。下村修回忆说，在科学层面，约翰逊确实没有教给自己更多的知识，他的进展全部来自于重复的实验和失败，或许他唯一从约翰逊那里学到的技能就是遇到任何的写作问题时都应该马上去查字典。然而，这并不妨碍约翰逊作为很好的协调者和管理者为下村修提供出一个优良的环境。充分的信任让下村修反而战战兢兢的对待自己的研究课题以不辜负这位导师兼朋友的期望。同时，实验室也提供了很好的配套条件，比如说约翰逊他们制作的水母切割机就可以高效率的完成水母发光的关键部分的拣选。可不要小看这些配套硬件，以为这就是一把刀或一把剪子就能做的事儿，如果要应对数以万计的水母切割工作，没有这样专门设计的机器的协助是很难想象的。 维多利亚水母（Aequorea Victoria） 水母的物种区分非常困难，通常仅从外型上来说，人们根据水母的体积、触手的多少，径向管的数量来区分不同的种别，但是由于这些特征都是高度塑性的，所以很难作为有效的准则。有些争议认为下村修当年找到的水母并不是维多利亚水母，而是极其相似的墨绿多管水母（Aequorea coerulescens），现在多数人都承认这二者确实有明显差别。 [Source: Kevin Raskoff] 总体而言，维多利亚水母是非常理想的研究发光现象的标的物。它会发出淡绿色的光，它的数量极大且又容易捕捉。基于当时的认知，下村修很自然的把下一步的工作重点放在了提纯维多利亚水母可能的荧光酶上面。但是这一次和此前在日本的研究有所不同，此次是在没有明确的提纯目标的情况下进行探索，这无疑更加的困难。首先要搞清楚是什么让水母发光的，而大量的重复试验枯燥又乏味，一时之间几乎没有任何进展，上一次那种意外带来的好运可能很难再次降临了。然而，事情就是这么古怪，幸运似乎特别偏爱着下村修。1961年的一天晚上，下村修即将准备离开实验室下班回家，他顺手把自己当天工作时加工完的液体倒进了一个水池，没想到就在他关灯后准备离开前回头看一眼的瞬间，竟然发现黑暗中的水池里隐隐发出亮光。下村修立刻来了精神，到底为什么这些液体这次会发光呢？这个水池有一个特殊之处是它同时连着实验室的养鱼缸，鱼缸里的废水通过水池排出。会不会是鱼的某些排泄物激发了光亮呢？下村修一开始也这么设想，不过稍后的认真排查很快确认出光和鱼没有关系，真正的因素是鱼池里海水盐分中的钙离子，在钙离子的作用下一种叫水母素（aequorin）的物质能够激发光亮，这种蛋白应该就是维多利亚水母发光的答案所在。 分离，提纯，很快的，水母素荧光素酶在实验室中被提取出来。在提纯后的水母素溶液中加入钙离子，它果然可以催化底物质腔肠素发生氧化还原反应从而释放出光亮。苦思冥想的答案似乎终于被找到了，但是疑团却接踵而至。实验室中水母素催化反应产生的光是蓝色光，而维多利亚水母在自然界中发射出的却是绿色光。这绝不能用颜色相近或者差不多之类的含糊说法来搪塞，因为这一明显的差异几乎肯定的意味着，水母素不是水母体内发光的的主要原因。实际上，就在下村修提纯水母素的同时，他已经分离出了另一种有趣的发光蛋白，只不过由于争抢论文发表时间的需要，在下村修和约翰逊于1962年发表他们关于提纯水母素这一主要工作成果的论文时（Extraction,purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from theluminous hydromedusan Aequorea），他们还没有来得及完全弄清楚这另一种蛋白到底是怎么回事，所以他们只是在论文的脚注中含糊的提到了一句，说研究中同时发现了另一种会变色的蛋白。这种蛋白在阳光下呈现绿色，在钨丝灯下呈现黄色，在紫外光下则呈现出强烈的绿色。 1956年，下村修和助手后藤俊夫（Toshio Goto，图右）正在使用逆流器进行实验。这张图片摄于他们完成海萤荧光素结晶工作不久。 [Source: nobelprize.org] 研究人员最喜欢的节奏就是在发表一个重要成果的同时已经直观的感觉到更有价值的成果在等待着他们，下村修现在就处在这样的状态下。这一个放在脚注里的还没有被研究透的但是却能够放射出绿色荧光的奇特蛋白极有可能就是通向成功的关键线索。那么，下村修的猜测是正确的吗？这个蛋白会是最后的答案吗？ |
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