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两大方法帮你搞定质粒构建

2018-01-27  医学院的...


质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA 连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。


质粒构建方式多样,常规的 T4 连接酶,以及最近更受欢迎的重组酶方式。下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构建质粒方法,通过比较,其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。


 

 


一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶,可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的 5’-P 末端和 3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合,该催化反应需 ATP 作为辅助因子。


1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切,一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个,尽量使载体的末端具有特异性,防止自连。


[可选酶切体系]

VECTOR                      3 ug

CutSmart Buffer           5 ul

限制性内切酶 1            1 ul

限制性内切酶 2            1 ul


酶切体系一般选择 50ul,试剂加好之后 37°C 孵育 6~8 小时,或适当延长时间,保证质粒酶切完全。每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体。


2.根据目的序列构建引物后,引物设计原则简单总结一下:


(1)前向引物:5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 1 酶切位点序列+基因正向引物序列 -3’ 端


(2)反向引物:5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端


如果目的基因片段较长的话,可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段


[可选 PCR 扩增体系]

ddH2O:14ul

10xTaq buffer:2ul

10um DNTP:1ul

10um primer F:0.5ul

10um primer R:0.5ul

模板 DNA:1ul

Taq 酶:1ul


[可选 PCR 扩增条件]

(1)95℃:5min

(2) 35cycle

     95℃:30s

     55℃:30s(退火温度可以根据目的引物TM值决定,一般退火温度根 据引物TM值降低5度)

     72℃:40s

(3)72℃:10min

(4)16℃:hold


引物扩增之后,首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小,然后通过胶回收,获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基,回收产物需要进行双酶切,双酶切方法与质粒酶切方法相同。


3. 载体与目的基因的连接,推荐在 10~20μ反应体系中进行接反应。


[可选连接体系]

载体                     25 ng   

退火产物              2 ul 

10 x T4 buffer      1 ul  

T4 DNA ligase     1 ul

T4 连接酶一般选择 4 度过夜


4. 转化


将连接产物转化到受体菌中(一般为 DH5a),涂板,培养过夜。


5. 挑取单克隆,并鉴定


挑去平板上的单克隆培养,可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。


 

 


下面开始重点介绍重组酶构建质粒,基于同源基因重组原理,适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆,无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆 50 bp~10 kb 片段,同时构建时间也大大缩短。


1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化,线性化完全,假阳性克隆低。酶切体系同上。


2. 对于使用重组方式连接来说,PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列,通过 PCR 扩增方式进行连接,PCR 的产物要纯化。


引物设计原则简单总结一下:


(1)前向引物:5’ 端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’ 端


(2)反向引物:3’ 端--基因反向扩增引物+下游克隆载体末端同源序列--5’ 端


如果设计的基因特异插入片段扩增产物长度较长,可以选择 PCR 方式进行目的引物的扩增。


[可选 PCR 扩增体系]

ddH2O                       14 ul

10 x Taq buffer           2 ul

10 um DNTP              1 ul

10 um primer F          0.5 ul

10 um primer R          0.5 ul

Vector                        1 ul

Taq 酶                        1 ul


[可选 PCR 扩增条件]

(1)95℃:5min

(2) 35cycle

     95℃:30s

     55℃:30s(退火温度可以根据目的引物TM值决定,一般退火温度根 据引物TM值降低5度)

     72℃:40s

(3)72℃:10min

(4)16℃:hold


PCR 扩增后,通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯化后的 PCR 产物不需要进行酶切,直接用于重组反应。


3. 目的引物与线性载体进行重组反应。


[可选重组体系]

5 × CE II Buffer           4 μl

线性化克隆载体          50~200 ng

插入片段扩增产物      20~200 ng

Exnase® II                  2 μl

ddH2O                        x ul


在冰水浴中配制,配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,置于 37 ℃ 反应 30 min。待反应完成后,立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。重组效率在反应 30 min 左右达到最高,反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率,这样大大减少了连接时间。


4. 转化


将连接产物转化到受体菌中(一般为 DH5a),涂板,培养过夜。


5. 挑取单克隆,并鉴定


挑去平板上的单克隆培养,可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。


最后,几个主要注意事项:


1. 载体克隆位点选择尽量选择无重复序列,且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%~60% 范围之内时, 克隆效率将达到最大.


2. 最适克隆载体与插入片段摩尔比为 1:2,即最适插入片段使用量为 0.06 pmol。这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得:


最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng(0.03 pmol)


最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng(0.06 pmol)


3. 双酶切 1 和 2,在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及 Activity in NEBbuffer 的问题,可在 NEB 公司主页的 Double Digest Finder 里面进行查询。


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